Полная версия

Главная arrow Товароведение arrow Пищевая биотехнология продуктов из сырья растительного происхождения

  • Увеличить шрифт
  • Уменьшить шрифт


<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>

БИОКОНВЕРСИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЕРМЕНТОВ

  • 3.1. Общая характеристика и классификация ферментов
  • 3.2. Ферментативная переработка растительного сырья
  • 3.2.1. Ферменты, трансформирующие органическое сырье
  • 3.2.2. Гидролитические процессы
  • 3.2.3. Негидролитические реакции

Ферментные препараты

Технология получения

Промышленная технология ферментных препаратов начала развиваться в первой четверти XX в. К настоящему времени ферментные препараты стали мощным средством трансформации практически любого вида биологического сырья, формирования качества продуктов. Применение ферментных препаратов позволило существенно увеличить глубину переработки пищевого сырья и кормов, улучшить органолептические свойства и создать новые виды пищевых продуктов, повысить усвояемость кормов и расширить сырьевую базу кормопроизводства.

При переработке различных видов органического сырья используются ферменты растительного, микробного и животного происхождения. Растительные ферменты специфичны в отношении своих естественных субстратов, что определяет высокую эффективность их действия на растительное сырье. Специфичность микробных ферментов совершенствовалась в процессе эволюции сапрофитных и фитопатогенных форм микроорганизмов. В микробном мире можно найти продуцентов всевозможных ферментов, участвующих в круговороте органического вещества. Это объясняет широкое применение микробных ферментов в пищевой промышленности и кормопроизводстве. Из животного сырья получают ограниченный ассортимент ферментных препаратов, которые, как более дорогостоящие, применяются реже микробных.

Основная масса ферментных препаратов производится на основе культивирования промышленных штаммов микроорганизмов, преимущественно продуцентов секретируемых (внеклеточных) ферментов.

Ферменты зерновых культур. В практической деятельности человека применяются с древних времен. Зерно злаков богато запасными веществами, которые используются в энергетическом и конструктивном метаболизме при прорастании зерна.

Превращение крахмала, крахмальных полисахаридов, белка, липидов начинается с их гидролитического расщепления. Продукты расщепления используются в циклах дыхания и биосинтеза структурных элементов растения. В покоящемся зерне имеются ферменты, необходимые для гидролиза всех видов полимеров. Значительная часть гидролитических ферментов находится в связанном, неактивном состоянии. Активность свободных форм гидролаз не проявляется из-за отсутствия свободной воды, необходимой для протекания реакций гидролиза.

В зерне имеются ингибиторы протеолитических ферментов и а-амилазы. Ингибиторы протеаз предотвращают протеолитический процессинг связанных ферментов и их переход в свободные, активные формы. При соответствующей температуре и влажности зерно набухает и прорастает. Процесс прорастания сопровождается увеличением активности большинства ферментов. Ингибиторы протеаз — белки с низкой молекулярной массой — диффундируют во внешнюю среду, что создает условия для проявления активности протеаз. Под действием протеаз активируются связанные формы ферментов. Параллельно осуществляется биосинтез новых ферментов.

Проросшее зерно (солод) — богатейший источник ферментов. Ферментативный комплекс солода включает: амилолитические ферменты (а- и (3-амилазу, а-глюкозидазу, пуллуланазу, предельную декстриназу), [3-фруктофуранозидазу, целлюлолитические ферменты (эндо- и экзоглюканазы, целлобиазу), гемицеллюлазы (эндо-[3-1,3-глюканазу, ламинарибиазу, эндо- и экзоксиланазы, ксилобиазу, арабинозидазу), протеазы эндо- и экзотипов, липазы, фосфатазы, окислительно-восстановительные ферменты (каталазу, пероксидазу, о-дифенолоксидазу).

Рациональная технология солода обеспечивает получение максимальной активности гидролитических ферментов при минимальных затратах массы зерна на дыхание. Активность ферментов в процессе прорастания изменяется в зависимости от влажности зерна, температуры среды, продолжительности выращивания, способа аэрации (табл. 3.2). При получении сухого солода его ферментативная активность зависит от способа сушки.

Оптимальные режимы солодоращения для разных культур

Культура

Температура,

°С

Влажность зерна,%

Продолжительность проращивания, сут

Ячмень двухрядный

13-15

46

7

Ячмень шестирядный

17-19

47-48

6

Рожь

18-20

48-50

3

Пшеница

16-18

46-48

3-4

Овес

15-18

42-43

5-6

Кукуруза

18-20

46-48

5

Наибольшее применение находят ячменный и ржаной солод, первый — в пивоварении, второй — в хлебопечении и при приготовлении квасного сусла. Высокой ферментативной активностью обладает солод из шестирядного озимого ячменя: амилолитическая и протеолитическая активность соответственно в 1,5—2 и 3—5 раз выше, чем в солоде из двухрядного пивоваренного ячменя.

Амилометические ферменты солода имеют сходные свойства. а-Амилаза присутствует в покоящемся зерне в незначительных количествах. Фермент активно синтезируется в процессе прорастания. Синтез индуцируют гиббереллины, образующиеся в ростке. Максимальная активность а-амилазы найдена в алейроновом слое.

Оптимальные условия действия фермента: pH 5,6—5,8; температура 60—65 °С. В заторах температурный оптимум повышается до 70—75 °С, а предел термостабильности — до 80 °С, что связано со стабилизирующим действием высоких концентраций крахмала в заторах. а-Амилаза солода активируется ионами кальция и хлора, ингибируется ионами железа, хрома, меди. В солоде присутствуют два изофермента а-амилазы. При длительном гидролизе крахмала солодовой а-амилазой получают смесь сахаров, состоящую на 87% из мальтозы и на 13% — из глюкозы.

(3-Амилаза находится в зерне в свободной и связанной формах. Связанная форма локализуется только в эндосперме. Активация ее происходит под действием протеаз и тиоловых агентов. (3-Амилаза накапливается в зерне в интервале от 2 до 5 сут проращивания, основная активность сосредоточена в алейроновом слое. Фермент имеет оптимум действия в разбавленных растворах крахмала при pH 4,6- 5,6 и температуре 40-50 °С, в заторах крахмалистого сырья — при 60—65 °С. Стабилен при pH 4-8 и температуре до 60 °С, в заторах — до 70 °С. Ингибиторы — ионы тяжелых металлов, галогены, озон.

[3-Амилаза расщепляет амилозу на 100% с образованием мальтозы. Гидролизу амилопектина препятствуют точки ветвления, вокруг которых долго сохраняются негидролизованные фрагменты полиглю- козидных цепочек. Крахмал в целом расщепляется с образованием около 50% мальтозы и такого же количества предельного Р-декстрина, дальнейшее расщепление которого может происходить при добавлении Р-амилазы. Полный комплекс амилолитических ферментов солода гидролизует зерновой крахмал на 100%.

При прорастании зерна существенно увеличивается активность Р-фруктофуранозидазы, эндо- и экзоглюканаз — в 10 раз; эндоксила- назы —в 3; экзоксиланазы — в 2; эндопептидазы —в 5—6; экзопептидаз — в 1,5—10; фосфатаз —в 5—10; липазы — в 2 раза. Целлобиазная активность, высокая в покоящемся зерне, при прорастании снижается. Это коррелируете повышением активности других целлюлолити- ческих ферментов, комплекс которых может расщеплять целлюлозу до глюкозы без участия целлобиазы.

Протеолитический комплекс солода включает эндо- и экзопептидазы. Эндопептидазы в зерне представлены свободной и связанной формой. Переход в свободную форму происходит за счет удаления ингибиторов (их протеолиза, диффузии во внешнюю среду). В комплексе экзопептидаз идентифицированы карбоксипептидаза, магнийсодержащая лейцинаминопептидаза и дипептидаза.

Протеолитические ферменты солода гидролизуют белок в зоне pH 4—9. Этот диапазон соответствует изменению величины pH в различных участках прорастающего зерна, что связано с гидролизом белка, превращениями аминокислот, синтезом органических кислот. Эти изменения отражаются в возрастании титруемой кислотности в процессе проращивания в 4—5 раз при незначительном увеличении средней величины pH (от 6 до 6,3). Компенсация активной кислотности происходит за счет буферного действия белков, фосфорор- ганических соединений, свободного фосфата, ионов органических кислот и металлов.

Сушка солода приводит к изменению абсолютной активности ферментов и соотношения ферментативных активностей, что объясняется ограниченной и различной термостабильностью компонентов ферментативного комплекса. В результате сушки амилолитическая активность светлого солода снижается на 30—40%, темного — на 70%. Потери происходят в основном за счет термоинактивации (3-амилазы, а-амилаза более стабильна. Снижение пептидазной активности при сушке светлого солода (температура 95—100 °С) незначительно. В темном солоде, который сушат в интервале температуры 112— 120 °С, наблюдается существенное снижение пептидазной и фосфатазной активности. Высокоферментативный солод из шестирядного ячменя рекомендуют сушить при температуре 72—80 °С.

Тиоловые растительные протеазы. Папаин, химопапаины А и В, бромелаин и фицин являются ферментами широкой субстратной специфичности. Они гидролизуют пептидные связи, образованные лейцином или глицином, которые часто встречаются в белках.

Папаин выделяют из сока дынного дерева путем фракционированного осаждения органическими растворителями. Аналогично получают бромелаин из сока зрелых стеблей ананаса и фицин из сока стеблей тропического инжира. Промышленный выпуск тиоловых протеаз растений производится в тропических странах, где произрастает сырье.

В пищевых отраслях широко применяется папаин, который изготовляют в различных товарных формах. В последние годы в нашей стране освоен выпуск препаратов папаина из незрелых плодов дынного дерева, которые ввозят из Эквадора. В выделяемом ферментном препарате протеолитическая активность составляет 750-1000 ед./г (по методу Ансона, субстрат — казеинат натрия). Ферментный комплекс включает: папаин, химопапаин, пептидазу А, незначительное количество лизоцима. Производится также иммобилизованная форма препарата (носитель — нейлоновое полотно) с высокой термо- и операционной стабильностью.

Микробные ферменты. В качестве продуцентов ферментов используются культуры представителей различных таксономических групп — бактерий, актиномицетов, микроскопических и высших базидиальных грибов. Последние в лабораторной и промышленной культуре ведут себя аналогично микроскопическим грибам.

К микроорганизмам — продуцентам ферментов предъявляются следующие требования: наличие высокой ферментативной активности; преимущественный синтез фермента или группы ферментов, превращающих определенный субстрат; генетическая стабильность по признаку синтеза фермента или ферментов; достаточно высокая скорость роста; способность расти на средах с доступными и недорогими источниками питания.

Среди микроорганизмов, обладающих высокой активностью определенного фермента, предпочтение отдается тем, которые в оптимальных физиологических условиях способны синтезировать преимущественно один фермент или группу родственных ферментов (например, только а-амилазу или только комплекс целлюлаз). Такое предпочтение связано с тем, что, во-первых, при направленном синтезе достигается наиболее высокая ферментативная активность; во-вторых, препараты с выраженной активностью определенных ферментов и отсутствием или следовыми количествами других ферментов могут применяться для воздействия на индивидуальные компоненты сложных субстратов; в-третьих, такие ферментные препараты удобны для составления мультиэнзимных композиций с заданной активностью нескольких ферментов.

Способность к активному синтезу одного или группы близких ферментов свойственна тем микроорганизмам, у которых биосинтез этих ферментов носит не конструктивный, а индуцированный характер, т.е. резко усиливается в присутствии индукторов, в качестве которых чаще всего выступают субстраты ферментов или продукты их неполного расщепления.

Важнейшим качеством продуцента фермента является его генетическая стабильность, которая выражается в способности сохранять на протяжении многих поколений определенный уровень биосинтеза фермента в соответствующих условиях. Генетическая стабильность присуща природным штаммам микроорганизмов, прошедшим длительный путь естественного отбора. Однако в практике часто используют штаммы, полученные искусственной селекцией, с применением мутагенов. Такие штаммы обладают высокой изменчивостью, нестабильностью признаков.

Необходима постоянная селекционная работа по поддержанию полезных признаков штаммов на определенном уровне. При этом опираются на известную корреляцию внешних (морфологических) и физиолого-биохимических признаков микроорганизмов. Контроль за появлением нежелательных форм ведут как путем их визуального обнаружения при рассевах штаммов, так и с помощью серологических методов, выявляя неактивные варианты по их реакции со специфическими сыворотками.

Неустойчивость генетических признаков — причина частой смены продуцентов ферментов в условиях промышленного производства. Смена штамма влечет за собой изменение ферментативного комплекса препаратов, физико-химических и каталитических свойств отдельных компонентов. Это может выражаться в изменении оптимальных условий действия ферментов (pH, температуры), термо- и pH-стабильности, устойчивости к действию ингибиторов и к протеолизу, способности атаковать нативный или модифицированный субстрат, соотношения продуктов реакции, предельной степени превращения субстрата.

Изменение таких характеристик, как гидрофобность фермента, величина молекулярной массы, изоэлектрическая точка, поверхностный заряд молекулы при определенном pH, отражается на технологических свойствах фермента, его поведении в процессах очистки и выделения, что влияет на состав и свойства ферментативного комплекса препарата. Изменение состава и свойств ферментативных комплексов наблюдается не только при смене штаммов-продуцентов, но и при появлении нехарактерных морфологических вариантов, образующихся в процессе естественной изменчивости культур микроорганизмов. Учитывая названные факторы, целесообразно периодически уточнять характеристики ферментных препаратов.

К чисто технологическим характеристикам продуцентов ферментов следует отнести их скорость роста, устойчивость к инфекции, отношение к источникам питания и другим внешним факторам. Культивирование продуцентов ферментов проводят в условиях стерильности (глубинный процесс) или максимально возможного приближения к ним (поверхностный твердофазный процесс). Очевидно, что сохранение чистоты культуры не менее важно, чем генетическая стабильность продуцента. Обеспечение стерильности облегчено при непродолжительном культивировании продуцента и наличии у него естественных механизмов защиты от инфекции. Стабильность уровня биосинтеза ферментов выше у микроорганизмов, способных развиваться в широком диапазоне изменения внешних факторов, таких как концентрация источников питания, реакция среды, уровень аэрации и пр. Исходя из экономических соображений, предпочитают использовать доступные и недорогие источники питания.

Ферментная промышленность выпускает широкий ассортимент препаратов микробного происхождения, продуцентами которых являются представители различных таксономических групп. Большую часть валового количества ферментов, особенно гидролитических, производят на основе культивирования бацилл (прежде всего, В. subtilis), микроскопических грибов родов Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, а также актиномицетов родов Actinomyces, Streptomyces. Чаще всего используют мезофильные штаммы аэробных микроорганизмов.

Преобладающим способом культивирования микроорганизмов является глубинный, основанный на выращивании продуцентов в стерильных жидких средах с принудительной аэрацией (для аэробных форм) и перемешиванием среды, при автоматическом регулировании параметров процесса, таких как температура, pH среды, ее окислительно-восстановительный потенциал, концентрация растворенного кислорода и пр.

Наряду с глубинным применяется поверхностный способ культивирования, когда культуры продуцентов выращивают на поверхности жидких и сыпучих (твердофазное культивирование) питательных сред (отруби, свекловичный жом, измельченное целлюлозосодержащее сырье, солодовые ростки и др.). Последние увлажняют и стерилизуют.

Приоритет отдают твердофазному процессу, так как условия культивирования продуцентов максимально приближены к естественным, в которых полностью реализуется биопотенциал микроорганизмов. Клетки микроорганизмов непосредственно контактируют с питательными субстратами и не подвергаются неблагоприятным механическим воздействиям, неизбежным при глубинном культивировании. Твердофазная культура хорошо аэрируется. В конце ферментации получают культуру в форме, удобной для выделения ферментных препаратов.

Глубинное культивирование используется как для аэробных, так и для анаэробных продуцентов, твердофазное — только для аэробных, а именно для микроскопических и высших базидиальных грибов.

Различают ферментные препараты растворимые и иммобилизованные. У растворимых препаратов активнаячасть растворяется в водной среде. По окончании ферментативной обработки субстрата растворимый препарат остается в реакционной среде и вторично не используется. Наряду с растворимыми выпускают также иммобилизованные ферменты. Иммобилизация — это включение объекта в изолированную фазу, которая отделена от фазы свободного раствора, но способна с ней обмениваться молекулами (субстратов, эффекторов).

Иммобилизованные ферменты получают путем связывания с носителями растворимых ферментов или клеток микроорганизмов, обладающих ферментативной активностью. Наиболее распространенные способы связывания — это сорбция на носителе, ковалентное связывание и включение в структуру гелей-носителей. Иммобилизация приближает условия функционирования ферментов к природным. В природе большая часть ферментов ассоциирована со структурами живых организмов или элементами окружающей среды, что важно для проявления активности ферментов и их стабильности.

Иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ перед растворимыми при проведении процессов промышленного биокатализа. Иммобилизованные ферменты можно изъять из реакционной среды, что позволяет контролировать ход ферментативной реакции и многократно использовать ферментные препараты. Каталитический процесс можно проводить непрерывно, пропуская растворы субстратов через реакторы с иммобилизованными ферментами. Продукты реакции не загрязняются примесями ферментных препаратов. Иммобилизованные ферменты имеют высокую операционную стабильность, а их каталитические свойства можно модифицировать, изменяя способ связывания и вид носителя.

Применение иммобилизованных ферментов позволило решить задачу создания крупных промышленных биокаталитических производств, с помощью которых производят аминокислоты, органические кислоты, сахара, органические растворители, метан, антибиотики, гормональные препараты, осуществляют очистку сточных вод и водоемов, биоконверсию органических отходов.

 
<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>