Полная версия

Главная arrow Математика, химия, физика arrow Биоорганическая химия

  • Увеличить шрифт
  • Уменьшить шрифт


<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>

Определение индивидуальности белка и аминокислотного состава.

Прежде чем приступить к определению качественного и количественного аминокислотного состава данного белка, необходимо убедиться в отсутствии в нем примеси других белков или иных компонентов. Для этого можно использовать следующие критерии:

  • ? кристаллизуемость;
  • ? гомогенность при ультрацептрифугировании или электрофорезе;
  • ? однотипность каталитической активности (для ферментов);
  • ? постоянство молекулярной массы (гельфильтрацией);
  • ? гомогенность при изучении различными хроматографическими методами.

Обычно анализ полипептидов начинают с определения аминокислотного состава, т.е. соотношения аминокислот в образце.

Определение аминокислотного состава включает полный гидролиз белка или пептида до составляющих его аминокислот. Количественное определение аминокислот в гидролизате проводят с помощью аминокислотного анализатора, в котором анализ смеси осуществляется реакцией с нингидрином (С. Мур, У. Стейн, 1958 г.). Современные анализаторы определяют 1 нмоль аминокислот за 1,5-2,0 ч, причем весь процесс автоматизирован. При полном гидролизе полипептидов теряется информация о первичной структуре, поэтому данный метод позволяет определить только количественные соотношения аминокислот и качественный состав белков.

Для определения первичной структуры белка комбинируют два метода: частичный гидролиз и определение N-концсвых аминокислот.

Частичный гидролиз.

Для частичного гидролиза полипептидной цепи комбинируют методы ферментативного гидролиза (например, трипсином) и химические методы (например, расщепление бромцианом BrCN).

Бромциан расщепляет пептидные связи, следующие за остатками метионина, трипсин — связи, образованные остатками лизина и аргинина. Фрагменты, полученные от двух гидролизатов белков, выделяют и для каждого определяют аминокислотную последовательность.

Сопоставление аминокислотной последовательности бромциановых и триптических пептидов позволяет однозначно выяснить их расположение вдоль полипептидной цепи. Иногда двух гидролизатов мало, тогда используют большее число расщеплений белковой цепи.

Последовательность аминокислот в полипептидной цепи воспроизводится по перекрыванию остатков аминокислот в бромциановых и триптических пептидах. Например:

 
<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>