Полная версия

Главная arrow Медицина arrow Вестник новых медицинских технологий, 2014, Том 21. №4

  • Увеличить шрифт
  • Уменьшить шрифт


<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>

ИССЛЕДОВАНИЕ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ И АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ГИБРИДНЫХ КОМПОЗИТОВ С ГИДРОКСИАПАТИТОМ НА ОСНОВЕ ПОЛИСТИРОЛА IN VITRO

О.Г. СИТНИКОВА*, С.Б. НАЗАРОВ*, О.В. АЛЕКСЕЕВА**, Н.А. БАГРОВСКАЯ**, М.М. КЛЫЧЕВА*, И.Г. ПОПОВА*

* Федеральное государственное бюджетное учреждение «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения Российской Федерации,

Победы, д. 20, Иваново, Россия, 153045, e-mail: Этот адрес e-mail защищен от спам-ботов. Чтобы увидеть его, у Вас должен быть включен Java-Script ”Учреждение Российской академии наук Институт химии растворов им. Г. А. Крестова РАН, Академическая, д. 1, Иваново, Россия, 153045, e-mail: Этот адрес e-mail защищен от спам-ботов. Чтобы увидеть его, у Вас должен быть включен Java-Script

Аннотация. В работе исследованы полистирольные композиты, полученные методом полива полимерных растворов (полистирола) на тефлоновую подложку и с последующим высушиванием образцов до постоянной массы при 293 К. Методом механического диспергирования проведена иммобилизация частиц гидроксиапатита в матрице полистирола. Концентрация гидроксиапатита в полимерных системах составила 0,03; 0,1; 0,5 мас.%. Определены сорбционные и структурные характеристики гидроксиапатита, такие как площадь удельной поверхности и объём пор. Исследовано влияние концентрации гидроксиапатита в композитах на процессы свободнорадикального окисления липидов и антиоксидантной активности «сливной» сыворотки крови и «сливной» сыворотки после контакта с композитом, содержащим гидроксиапатит in vitro. На основании хемилюминесцентного анализа установлено, что полимерные композиты с концентрацией гидроксиапатита 0,1 и 0,5 мас.%. повышают показатели хемилюминесценции: быстрая вспышка Imax и светосумма S, что свидетельствовало об активации свободнорадикальных процессов, при этом увеличивался тангенс угла наклона кривой tga и снижались параметры а и Z, что отражало увеличение антиоксидантной активности. Проведено исследование содержания малонового диальдегида и суммарной антиоксидантной активности сыворотки крови методом спектрофотометрии. Отмечено увеличение показателя антиоксидантной активности после воздействия композита, содержащего 0,5 мас.% гидроксиапатита в «сливной» сыворотке крови что подтверждает антиоксидантный эффект композита по сравнению с контрольной сывороткой крови.

Ключевые слова: гидроксиапатит, свободнорадикальное окисление липидов, антиоксидантная активность, хемилюминесценция.

THE STUDY OF FREE RADICAL PROCESSES AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF HYBRID COMPOSITES WITH HYDROXYAPATITE ON THE BASIS OF POLYSTYRENE IN VITRO

O.G. SITNIKOVA*, S.B. NAZAROV*, O.V. ALEKSEEVA**, N.A. BAGROVSKAY’*, M.M. KLYCHEVA*, I.G. POPOVA*

*State Research Institute of Maternity and Childhood, Victory,. 20, Ivanovo, Russia, 153045, e-mail: Этот адрес e-mail защищен от спам-ботов. Чтобы увидеть его, у Вас должен быть включен Java-Script **Institute of Solution Chemistry, Russian Academy of Sciences, Academic, 1, Ivanovo, Russia, 153045, e-mail: Этот адрес e-mail защищен от спам-ботов. Чтобы увидеть его, у Вас должен быть включен Java-Script

Abstract. The polystyrene composites, received by application polymeric solution (polystyrene) on teflon base sheet with the following samples drying at 293 К to constant mass were studied. The hydroxiapatite particles immobilization in polysterene matrix was made by mechanical dispersion. The polimeric's systames hydroxiapatite concentration were 0,03; 0,1; 0,5 mac.%. The authors determined sorption and structural hydroxiapatite's characteristics such as specific surface area and pore volume. The authors studied the influence of hydroxiapatite concentration in composites on lipid free radical processes and antioxidant activity of confluent blood serum and confluent serum after contact with composite, including hydroxiapatite in vitro. It was noted that polymeric composites with 0,1 and 0,5 mac% hydroxiapatite concentration increase the hemiluminescence parameters based on hemiluminescence analysis: fast flashes Imax and lightsum

S. These data argue for free radical processes activation, so curve slope ratio increased tga and parameters A and Z decreased. It's reflects the antioxidant activity increasing. The authors performed the investigation of malonic dialdehyde content and total blood serum antioxidant activity by spectrophotometry. The antioxidant activity increasing after composites impact, including 0.5mac% hydroxiapatite in confluent blood serum was determined. These data argue for composites' antioxidant effects in comparison with control blood serum.

Key words: hydroxiapatite, lipid free radical process, antioxidant activity, hemiluminescence.

В настоящее время внимание ученых привлечено к проблеме получения экологически безопасных, гибридных полимерных материалов, содержащих в качестве наполнителей частицы гидроксиапатита - Саш(Р04)б(0Н)2 (ГАП). Известно, что ГАП является основным минеральным компонентом натуральной костной ткани. Он образует пористую трехмерную матрицу, определяющую высокие физикомеханические характеристики кости [6].

Исследования по влиянию ГАП на биохимические процессы в живых организмах не многочисленны. Рядом авторов была исследована интенсивность перекисиого окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантная активность гомогенатов печени и мышц крыс после двусторонней овариоэкгомии и инъекций аллогенного гидроксиапатита. Выявлено, что введение определенной концентрации аллогенного ГАП способствует нормализации процессов ПОЛ и повышает активность каталазы - фермента, входящего в состав антиоксидантной системы [3].

В работах других авторов отмечено, что наночастицы ГАП обладают противоопухолевым эффектом, механизм действия которого не ясен, но in vitro показано, что введенные в клетки глиомы наночастицы ГАП стимулируют оксидантный сгресс, приводящий к накоплению АФК и усилению апоптоза, что, в свою очередь, снижает активность антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы (СОД) [10].

Большинство ранее представленных в литературе работ посвящено композиционным материалам с ГАП, предназначенным для использования в ортопедии, челюстно-лицевой хирургии и тканевой инженерии [9]. В этой связи развитие новых методов, позволяющих включать частицы ГАП в полимерную матрицу, позволят создавать композиты целевого назначения для биохимии и медицины, которые также как и порошок ГАП, будут способны усиливать пролиферативную активность остеобластов, усиливать процессы репаративного остеогенеза на месте введения материала, задерживать развитие воспалительной реакции в костной ране [8].

В экспериментальной работе представлены данные по стимулирующему действию композитов на основе природного биополимера каррагинана и ГАП

на лейкопоэз [2].

Антиоксидантная активность композитов с ГАП основе синтетических полимеров практически не изучена. В то же время в работе [1] показано, что композиты на основе полистирола и неорганического наполнителя, фуллерена, способны проявлять антиоксидантные свойства в процессе перекисиого окисления липидов в сыворотке крови. В этой связи возникает определенный интерес к исследованию влияния синтетических полимерных композитов с ГАП на свободнорадикальные процессы и антиоксидантную активность в биологических жидкостях (сыворотка крови) in vitro.

Цель работы - исследование свободнорадикальных процессов и антиоксидантной активности гибридных композитов с различными концентрациями ГАП на основе полистирола in vitro.

Материалы и методы исследования. В качестве полимерной матрицы для получения композита был выбран атактический полистирол (ПС) с М Г105 Aldrich (США). Наполнителем служил порошок ГАП марки Aldrich (США) общей формулы - Саю (Р04)б(0Н)г. Размер частиц ГАП определяли методом лазерной дифракции на анализаторе размера частиц «Analysette 22» COMPACT с диапазоном измерения от 0,3 до 300 мкм, установлено, что образцы ГАП, в основном, содержат микрочастицы с размерами от 60 до 90 мкм, мезопористой структуры. Растворы ПС в о- ксилоле и полимерные системы с ГАП готовили гравиметрически и далее перемешивали на магнитной мешалке со скоростью 180 об/мин в течение 72 часов до получения однородного геля. Концентрация ГАП в полимерных системах составляла 0,03; 0,1; 0,5 мас.%. Пленки получали методом полива полимерных растворов на тефлоновую подложку с последующим высушиванием образцов до постоянной массы при 293 К. Толщина пленок составляла 60-70 мкм.

Для исследования влияния полученных композиционных пленок на свободнорадикальные процессы и антиоксидантную активность in vitro использовали «сливную» сыворотку крови от 10 пациенток гинекологической клиники ФГБУ «Ив. НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова» Минздрава России. Все пациентки при поступлении в клинику

Показатели индуцированной хемилюминесценции «сливной» сыворотки крови под действием контакта с ПС пленкой и композитами, содержащими Г АП

Концентрация

ГАП

в композите, %

Показатели хемилюминесценции, % Медиана [25; 75 перцентели]

Исследуемые

пробы

I шах

S

а

Z

tga

Контроль

п=10

100

[100; 100]

100

[100; 100]

100

[100; 100]

100

[100; 100]

100

[100; 100]

ПС пленка, п=10

101

[101; 102]

98

[96; 102]

98

[94; 981

98

]94; 981

97

[92; 1001

0,03%,

п=10

102

[97; 107]

101

[95; 102]

101

[96; 102]

102

[95; 104]

100

[100; 100]

0,1 %, п=10

ИЗ*

[105; 121]

110*

[104; 121]

98

[96; 100]

98

[96; 100]

116*

[104; 127,5]

0,5 %, п=10

112* [107; 20]

110*

[100; 114]

95*

[89; 1011

94*

[86; 103]

123*

[112; 146]

Примечание: здесь и далее звездочкой * отмечены достоверные отличия по отношению к контролю, таким образом: * - р<0,05

подписывали информированное согласие на обследование, включающее взятие крови других процедур, на что имелось одобрение этического комитета. Забор крови осуществлялся у небеременных женщин, поступивших в клинику с нарушениями менструальной функции экдокринного генеза.

Предварительно пробирки, содержащие 1 мл «сливной» сыворотки крови и образцы исходной или композиционной пленок размером 1,5 см2 и массой 5 мг с определенной концентрацией ГАП (0,03; ОД и 0,5 мае. %), инкубировали при 4 С° с целью снижения влияния микробиологических факторов в течение 1 часа, контролем служила «сливная» сыворотка крови без композита. Определение концентрации свободных радикалов и антиоксидантную активность в исследуемых образцах проводили методами индуцированной хемилюминесценции (ХЛ). В качестве индукторов ХЛ использовали перекись водорода (Н2О2) с сульфатом железа II (FeS04). Метод основан на каталитическом разложении перекиси водорода ионами двухвалентного железа по реакции Фентона, образующиеся при этом свободные радикалы вступают в процесс инициации СРО в исследуемом биологическом субстрате. При рекомбинации свободных радикалов происходит выделение квантов света, которые регистрировались прибором «БХЛ-07» (фирма «Ме- дозон», Нижний Новгород, Россия) в течение 40 секунд. Для регистрации ХЛ в измерительную кювету биохемилюминометра вносили 0,1 мл сыворотки крови, 0,4 мл фосфатного буфера pH 7,5, 0,4 мл раствора сульфата железа (0,05 мМ), 0,2 мл 2% раствора пергидроля, помещали в измерительную камеру прибора и регистрировали ХЛ. Для оценки ХЛ регистрировали значение максимальной интенсивности свечения (Imax) за все время опыта; светосумму свечения (S), го есть площадь под кривой после достижения максимума; безразмерный параметр (а), характеризующий полную относительную интенсивность излучения за время измерения; нормированную светосумму (Z) за время измерения; тангенс угла наклона кривой хемилюминесценции - tga. Показатели Imax и S дают представление о потенциальной способности биологического объекта к свободнорадикальному окислению липидов, антиоксидантный потенциал коррелирует с параметрами - a, Z, tga, так снижение величин а и Z и повышение tga свидетельствует о повышении антиоксидантной активности. Содержание малонового диальдегида (МДА), конечного продукта ПОЛ, проводилось по методу, основанному на образовании триметинового комплекса МДА с 2- гиобарбитуровой кислотой [6,7]. Определение показателя суммарной антиоксидантной активности (АОА) определяли по методу [4]. Показатели «сливной» сыворотки (контроль) были приняты за 100%.

Статистическую обработку данных проводили с помощью стандартного пакета программ SDS. Учитывая характер распределения, отличный от нормального, описание представлено в виде медианы - середины распределения изучаемого признака и интерквартилыюго интервала (ME[Q2s; Q75]) Сравнение средних величин в группах проводили с использованием критерия Wilcoxona. Статистически значимыми считали различия при р=0,05 [5].

Результаты и их обсуждение. Исследование влияния полученных композиционных пленок на свободнорадикальные процессы и антиоксидантную активность была изучена методом хемилюминесцентного анализа «сливной» сыворотке крови in vitro. Кинетика индуцированной ХЛ, сопровождающая окисление липидов, была исследована в системах после контакта сыворотки крови с ПС и композиционными пленками. На рис. представлены кинетические хемилюминесцентные зависимости, характеризующие протекание свободнорадикального окисления (СРО) липидов. В табл. 1 суммированы основные показатели ХЛ для всех исследуемых систем.

Кинетика ХЛ в различных системах

Рис. Кинетика ХЛ в различных системах: 1 - «сливная» сыворотка крови; 2 - сыворотка крови после контакта с ПС пленкой; 3,4,5 с композитами, содержащими 0,03, 0,1 и 0,5 мас.% ГАП, соответственно

Таблица 1

Всплеск свечения ХЛ, связанный с выходом свободных радикалов, наблюдался в течение 2 секунд от начала реакции. При этом интенсивность свечения

Показатели перекисного окисления липидов (МДА, АОА) «сливной» сыворотки крови под действием контакта с ПС пленкой и композитами, содержащими ГАП

Концентрация ГАП к композите,

%

Показатели ПОЛ, % Медиана [25; 75 процентели]

МДА

АОА

Контроль

п=10

100

[100; 100|

100

[100; 100]

0,5 %, п=10

98

[92; 100]

116*

[111; 117]

(Imax) по сравнению с аналогичным показателем для контрольной сыворотки крови достоверно возрастало с увеличением концентрации ГАП в композите, (табл. 1), что связано с усиленным образованием в биологической жидкости свободных радикалов липидов и активных форм кислорода (НСЬ*, 02*, От, ОН*). Следует отметить, что значения показателей хемилюми- нисценци быстрая вспышка Imax и светосумма S оказалось увеличенными только в сыворотке крови, после воздействия композитов с концентрациями ГАП: для Imax - 0,1 мас.% (р=0,0051) и 0,5 мас.%, (р=0,0069), для

S. - 0,1 мас.% (р=0,0077) и 0,5 мас.%, (р=0,0209). При воздействии на систему композита, содержащего 0.03 мас.% ГАП, достоверного увеличения показателей Imax (р=0,5896) и S (р=0,8927) не отмечено.

Достоверное повышение показателя тангенса угла наклона - tga (р=0,0051), характеризующего максимальную крутизну спада хемилюминесцентной кривой, с концентрацией ГАП 0,1 и 0,5 мас.%, и снижение величины Z - нормированной светосуммы композита с концентрацией ГАП 0,5 мас.% (р=0,0468), (табл.1) свидетельствуют о том, что эти композиты могут влиять на реакцию свободнорадикального окисления как антиоксиданты. Вероятно, введение в «сливную» сыворотку крови композита с более высоким содержанием ГАП, активизирует звенья антиоксидантной защиты.

Достоверного изменения показателей ХЛ в «сливной» сыворотке крови после воздействия исходной полистиролыюй пленки (концентрация ГАП 0%) не выявлено.

Интенсивность ПОЛ в исследуемых образцах сыворотки крови была также оценена по содержанию МДА и показателя суммарной АОА сыворотки крови методом спектрофотометрии.

Отмечено, что после воздействия композита, содержащего 0,5 мас.% ГАП, в «сливной» сыворотке крови увеличение показателя АОА (р=0,0431), что свидетельствует об антиоксидантном эффекте композита в данной системе по сравнению с контрольной сывороткой крови (табл. 2).

Таблица 2

Выводы:

  • 1. Выявлено, что полимерные композиты с концентрацией частиц 0,1 и 0,5% мае. гидроксиапатита обладают способностью активизировать свободнорадикальные процессы.
  • 2. Установлен антиоксидантый эффект полимерных композитов при концентрации частиц гидроксиапатита 0,1 и 0,5% мае.

Литература

1. Алексеева О.В., Багровская Н.А., Ситникова

O. Г., Назаров С.Б. Исследование антиоксидантной активности нанокомпозитов на основе полистирола in vitro // Жидкие кристаллы и их практическое ис- полыцование. 2011.№3. С. 90-96.

  • 2. Захаров Н.А., Скибинский К.В., Байриков И.М., Мизина П.Г., Кузьмина В.Е., Ермак И.М., Чалых А.Е., Калинников В.Т. Синтез и исследование органоминерального нанокомпозита гидроксиапатит кальция/каррагинан // Конденсированные среды и межфазные границы. 2007. Т. 9. № 2. С. 112-124.
  • 3. Писарева Е.В., Власов М.Ю., Орлова Е.В. Влияние аллогенного гидроксиапатита на активность каталазы, уровень диеновых и малонового диальдегида у крыс // Вестник Самарского государственного университета. Естественнонаучная серия. 2012. № 9(100). С.217-225.
  • 4. Промыслов М.Ш., Демчук М.Л. Модификация метода определения антиоксидантной активности сыворотки крови // Вопросы медицинской химии. 1990. № 4. С. 90-92.
  • 5. Реброва 0.10. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: МедиаСфера, 2002. 312 с.
  • 6. Рожинская Л. Я. Системный остеопороз. М.: Мокеев, 2000. С. 29-51.
  • 7. Ситникова О.Г., Назаров С.Б., Дюжев Ж.А., Клычева М.М., Попова И.Г., Алексеева О.В., Агафонов А.В. Исследование влияния различных видов наноразмерного диоксида кремния на развитие ок- сидантного стресса и антиоксидантную активность in vitro // Вестник новых медицинских технологий. 2013. №3. С. 17-21.
  • 8. Ishihara М. Studies on lipoperoxide of normal pregnant women and patient toxemia of pregnancy // Clin. Chim. Acta. 1978. Vol. 84. P. 1-9.
  • 9. Effect of calcium carbonate on clinical compliance of apatitic calcium phosphate bone cement / Khairoun I. [et al.] // J Biomed Mater Res. 1997. № 38.

P. 356-360.

  • 10. Chapman M.W., Bucholz R., Cornell C. Trea- ment of acute fractures with a collagen-calcium phosphate graft material. A randomized clinical trial // J. Bone Joint. Surg. Am. 1997. № 4. P. 495-502.
  • 11. Oxidative stress and apoptosis induced by hydroxyapatite nanoparticles in C6 cells / Xu J. [et al.] // J. Biomed Mater Res A. 2012. № 3. P. 738-745.

References

  • 1. Alekseeva OV, Bagrovskaya NA, Sitnikova OG, Nazarov SB. Issledovanie antioksidantnoy aktivnosti nanokompozitov na osnove polistirola in vitro. Zhidkie kristally i ikh prakticheskoe ispol'shchovanie. 2011;3:90-
  • 6. Russian.
  • 2. Zakharov NA, Skibinskiy KV, Bayrikov IM, Mi- zina PG, Kuz'mina VE, Ermak IM, Chalykh AE, Kalinnikov VT. Cintez i issledovanie organomineral'nogo nano- kompozita gidroksiapatit kal'tsiya/karraginan. Konden- sirovannye sredy i mezhfaznye granitsy. 2007;9(2):112- 24. Russian.
  • 3. Pisareva EV, Vlasov MYu, Orlova EV. Vliyanie allogennogo gidroksiapatita na aktivnost' katalazy, uro- ven' dienovykh i malonovogo dial'degida u krys. Vest- nik Samarskogo gosudarstvennogo universiteta. Estest- vennonauchnaya seriya. 2012;9(100):217-25. Russian.
  • 4. Promyslov MSh, Demchuk ML. Modifikatsiya metoda opredeleniya antioksidantnoy aktivnosti syvo- rotki krovi. Voprosy meditsinskoy khimii. 1990;4:90-2. Russian.
  • 5. Rebrova OYu. Statisticheskiy analiz meditsins- kikh dannykh. Primenenie paketa prikladnykh pro- gramm STATISTICA. Moscow: MediaSfera; 2002. Russian.
  • 6. Rozhinskaya LYa. Sistemnyy osteoporoz. Moscow: Mokeev; 2000. Russian.
  • 7. Sitnikova OG, Nazarov SB, Dyuzhev ZhA, Kly- cheva MM, Popova IG, Alekseeva OV, Agafonov AV. Issledovanie vliyaniya razlichnykh vidov nanorazmer- nogo dioksida kremniya na razvitie oksidantnogo stres- sa i antioksidantnuyu aktivnost' in vitro [The nanoparticles of silica derivates affect oxidative stress progression and antioxidant activity in vitro]. Vestnik novykh meditsinskikh tekhnologiy. 2013;3:17-21. Russian.
  • 8. Ishihara M. Studies on lipoperoxide of normal pregnant women and patient toxemia of pregnancy. Clin. Chim. Acta. 1978;84:1-9.
  • 9. Khairoun I, et al. Effect of calcium carbonate on clinical compliance of apatitic calcium phosphate bone cement. J Biomed Mater Res. 1997;38:356-60.
  • 10. Chapman MW, Bucholz R, Cornell C. Treament of acute fractures with a collagen-calcium phosphate graft material. A randomized clinical trial. J. Bone Joint. Surg. Am. 1997;4:495-502.
  • 11. Xu J, et al. Oxidative stress and apoptosis induced by hydroxyapatite nanoparticles in C6 cells. J. Biomed Mater Res A. 2012;3:738-45.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 12-03-97528-р_центр_а

УДК: 612.087.1, 681.518.22 DOI: 10.12737/7286

 
<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>