Полная версия

Главная arrow Медицина arrow Вестник новых медицинских технологий, 2014, Том 21. №4

  • Увеличить шрифт
  • Уменьшить шрифт


<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>

ВЛИЯНИЕ МЕТАБОЛИТОВ БАКТЕРИЙ BACILLUS SP. ИЗ ВЕЧНОЙ МЕРЗЛОТЫ НА СКОРОСТЬ РЕПАРАЦИИ КОЖНОЙ РАНЫ

Л.Ф. КАЛЁНОВА, А.С. БАЖИН, М.А. НОВИКОВА

Тюменский научный центр СО РАН, ул. Малыгина, 86, Тюмень, Россия, 625026

Аннотация. Ископаемые бактерии - эволюционно ценные формы жизни. При существовании в условиях мерзлоты в течение очень длительного времени бактерии могли выработать уникальные механизмы репарации структурных и функциональных дефектов. В эксперименте на мышах линии BALB/c установлено наличие высокого репаративного потенциала у ископаемых бактерий штамма MG8 Bacillus sp., выделенных из проб реликтовой мерзлоты, и продуктов их жизнедеятельности - метаболитов, который они могут делегировать другим живым системам. Способность к регуляции репаративных процессов в макроорганизме проявляется у MG8 в дозах меньше 20><103 м.кл. и локальном нанесении на раневую поверхность. Явным лидером модуляции репаративных процессов при заживлении дефектов кожи являются «тепловые» метаболиты, полученные при культивировании бактерий при 37°С. При локальном нанесении на рану мази с «тепловыми» метаболитами процесс репарации ускоряется на 30% относительно плацебо, на 20% относительно лекарственного препарата «Солкосерил» и на 10% быстрее, чем под влиянием самих бактерий. Динамика формообразовательных процессов при заживлении дефекта кожи под влиянием бактерий MG8 и их метаболитов коррелирует с динамикой активности иммунной системы. Последовательность изменения активности различных звеньев иммунной системы (клеточные факторы врожденной иммунорезистентности - клеточный иммунитет - гуморальный иммунитет) соответствует этапно- сти развития репарационного процесса (повреждение - воспаление - восстановление). Механизмы регуляции репарационным процессом у иммунной системой соответствуют общим закономерностям регуляции воспалительного процесса и изменяются волнообразно: преимущественное повышение активности провоспалительных механизмов сменяется преимущественным повышением активности противоспалительных механизмов иммунной системы. Использование метаболитов штамма MG8 способствует оптимизации регенераторного процесса, сокращению времени контракции раны, уменьшению образования рубцовой ткани, более полноценному восстановлению шерстного покрова на основании чего их можно отнести к модуляторам раневого процесса с преобладанием механизмов регенерации

Ключевые слова: микроорганизмы из многолетнемерзлых пород, кожные раны, репарация, скорость репарации, реактивность иммунной системы.

EFFECTS OF METABOLITES OF BACTERIA BACILLUS SP. FROM PERMAFROST ON SPEED REPAIR OF SKIN

WOUND

L.F. KALENOVA, A.S. BAZHIN, M.A. NOVIKOVA

Tyumen Scientific Center, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, st. Malygina, 86, Tyumen, Russia, 625026

Abstract. Fossil bacteria are evolutionarily valuable forms of life. In permafrost conditions for a very long time, bacteria can develop a unique repair mechanisms of structural and functional defects. In the experiment on mice of BALB/c it was revealed the presence of high reparative capacity in fossil bacteria strain MG8 Bacillus sp., isolated from samples of relict permafrost, and their metabolic products - metabolites that can be delegated to other living systems. Ability to regulate reparative processes in macroorganism shows in MG8 in the doses less than 2O1103 microbial cells and topically on the wound surface. The "thermal" metabolites, produced by culturing the bacteria at 37°C, are leaders modulation of repair processes in healing skin blemishes. Local application on the wound ointment with "heat" metabolites allows to accelerate by 30% the process of reparation relative to placebo, by 20% - relative to the medicinal product "Solcoseryl" and by 10% - faster than under the influence of bacteria. Dynamics of morphogenetic processes in the healing of skin defect under MG8 bacteria effect and their metabolites is correlated with the dynamics of immune system activity. The sequence of changes in the activity of various components of the immune system (cellular factors inherent immunoresis- tance - cell immunity humoral immunity) corresponds to the stage of development of the repair process (damage - inflammation - recovery). Mechanisms of regulation of repair processes in the immune system consistent with the general laws regulating the inflammatory process and changes in waves: the predominant increase in the activity of pro- inflammatory mechanisms replaced predominant anti-inflammatory mechanisms of increased activity of the immune system. Using strain MG8 metabolites allows to optimize regenerative process, to reduce time of wound contraction and the formation of scar tissue, to full restore of the coat, so they can be modulators of the wound process, with a predominance of regeneration mechanisms

Key words: microorganisms from permafrost, skin wounds, repair, repair rate, reactivity of the immune system.

Вся цепочка взаимосвязанных биологических процессов при посттравматической регенерации кожной раны предъявляет высокие требования к репаративным способностям организма. В единой причинно-следственной цепи раневого процесса выделяют три стадии - фазу воспаления, фазу регенерации с образованием и созреванием грануляционной ткани и фазу образования соединительнотканной основы дермы и эпителизации. В восстановлении тканевого гомеостаза принимают непосредственное участие обменные процессы, биохимические и иммунные реакции [9]. Бактериальная контаминация, с одной стороны, значительно замедляет процесс регенерации поврежденных тканей, с другой - умеренная контаминация бактериями дополнительно стимулируя активность иммунокомпетентных клеток способствует заживлению [1,3,8,14,16].

Для получения лекарственных препаратов, как правило, используют лекарственное растительное сырье и продукты химического синтеза, и значительно реже для этих целей применяются бактерии.

Вместе с тем, использование бактерий в качестве сырья может быть достаточно перспективным, ввиду высокого содержания в них важных биологически активных веществ. Кроме того, высокая скорость роста бактерий позволяет культивировать их в больших количествах за достаточно короткое время, что делает использование их в качестве сырья рентабельным. Есть данные о позитивном влиянии продуктов жизнедеятельности (метаболитов) микроорганизмов на процессы регенерации тканей [4,5].

Поиск штаммов, способных стимулировать процессы репарации, представляет несомненный интерес. Возможными объектами могут быть реликтовые бактерии, выделенные из проб многолетнемерзлых пород, как эволюционно ценные формы жизни. Известно, что скорость эволюции прямо отражает совокупность диалектического взаимодействия эффективности и ошибочности процессов репарации поврежденных структур. При существовании в экстремальных условиях в течение очень длительного времени (от нескольких тысяч до миллионов лет) бактерии могли выработать уникальные механизмы репарации структурных и функциональных дефектов. Ранее проведенные нами исследования показали, что при парентеральном введении лабораторным животным отдельные штаммы бактерий из вечной мерзлоты оказывают модулирующее влияние на активность иммунной системы, повышают качество и продолжительность жизни [10,11]. Поиск путей и перспектив совершенствования лечебных мероприятий с использованием репарационного потенциала бактерий означал бы ощутимый прогресс в решении фундаментальных и прикладных задач биологии и медицины.

Цель исследования - изучить влияние метаболитов ископаемых бактерий Bacillus sp. штамм MG8 из многолетнемерзлых пород на скорость репаративных процессов на модели кожной рапы.

Материалы и методы исследования. Эксперимент проведен на 192 мышах линии BALB/c (белый цвет шерсти), <$, весом 19-22 г. У 160 животных под эфирным наркозом формировали кожную рану, 32 животных оставались интактными. Выбор модели кожной раны был обусловлен скоростью процессов репарации, так как кожа относится к интенсивно обновляющимся тканям. В качестве базовой использовалась модель плоскостной полнослойной асептической кожной раны по Турищеву С.Н. в нашей модификации. Наша модификация состояла из двух пунктов: 1 - рану формировали в задней трети спины справа от позвоночника; 2 - использовался трафарет из тонкого оргстекла с отверстием 3,5x7,0 мм, в которое кожа животного вытягивается за шерсть на высоту около 1 мм и делается срез. При таком способе формируется рана овальной формы площадью 55-65 мм2. Преимущества данной модификации: 1 - удобство фиксации животного исследователем при проведении измерений и снижение болезненности для животного при манипуляциях; 2 - снижение риска первичного микробного загрязнения; 3 - стандартизация размеров раневой поверхности и высокая точность измерения площади.

В данном эксперименте исследовали репарационный потенциал метаболитов ископаемого штамма MG8 Bacillus sp. (РМО), выделенного из образцов реликтовой мерзлоты позднего неогена Центральной Якутии возрастом более 3 миллионов лет [2]. Для проведения исследования РМО культивировали при 26°С (оптимальная температура роста данного штамма) 24 часа на ГРМ-агаре («Биокомпас-С», г. Углич) и готовили аликвоты из расчета 2><106 микробных клеток (м.кл.) на 1 мл физиологического раствора. Учитывая зависимость метаболизма бактерий от температуры (изменение ферментативной стратегии на количественном, качественном и конформационном уровнях, в частности синтезе «холодовых» или «тепловых» изоферментов), аликвоты РМО инкубировали при отрицательных (-5°С) или положительных (37°С) температурах в течение 72 часов в физиологическом растворе. Метаболиты отделяли от микробных клеток, пропуская через микробиологические фильтры (Millipore, 0,22 urn, White GSWP, 25 mm, USA) в стерильные пенициллиновые флаконы. Чистоту препаратов оценивали путем посева полученных метаболитов на плотные питательные среды.

Для получения лечебных препаратов микроорганизмы в дозе 2х106 м.кл./мл и метаболиты от 2х106 м.кл./мл соединяли с равным объемом геля из 2% целлюлозы. Для получения мазевой композиции для контроля плацебо в 2% целлюлозу добавляли равный объем физиологического раствора. Расчет концентрации бактерий проводили исходя из известных данных:

  • 1. критическим уровнем численности бактерий в ране большинства известных видов микроорганизмов является 105 м.кл. на 1 г ткани;
  • 2. ранее проведенные нами исследования показали выраженный иммуномодулирующий эффект у РМО в дозах от 5-103 до 50-103 м.кл. [10].

Учитывая, что на рану площадью 55-65 мм2 можно нанести 15-20 мкл испытуемого вещества в виде мази, конечная численность бактерий в ране составляет менее 20-103 м.кл. (или метаболитов от аналогичного числа бактерий). В качестве контроля лекарственного препарата использовали гель «Солкосерил» (Швейцария). Животных разделили на 6 групп: 1 - интактный контроль (К); 2 - обработка раны гелем контроль плацебо (КП); 3 - обработка раны «Солкосе- рилом» - контроль лекарственного препарата (КС); 4 - обработка раны гелем с РМО; 5 - обработка раны гелем с «холодовыми» метаболитами, полученными после инкубации РМО при температуре -5°С (МБ-Х); 6 - обработка раны гелем с «тепловыми» метаболитами (МБ-Т), полученными после инкубации РМО при температуре 37°С. Лечение животных начинали сразу же после нанесения травмы и проводили один раз в день 5 дней подряд.

Ежедневно проводили взвешивание животных (г) через 2 часа после кормления, визуальную оценку состояния раневой поверхности и фотографирование раны. Раны фотографировали рядом с линейкой фотоаппаратом, зафиксированным на штативе на расстоянии 15 см от поверхности линейки. Площадь раны вычисляли при компьютерной обработке фото. Скорость контракции раны вычисляли по формуле: V=(Sn-S)/Soxl00%, где Sn - площадь раны при предыдущем измерении, S - площадь раны при данном измерении, So - исходная площадь раны, V - скорость контракции раны, выраженная в процентах. В течение первых 7 суток проводили измерение температуры ядра тела животных медицинским цифровым термометром «Diqital thermometer» AMDT-12 (Япония). Эвтаназию животных проводили методом дислокации шейных позвонков на 3, 7 и 21 сутки после моделирования раны и оценивали состояние иммунной системы (по 8 животных из группы). На дополнительной группе интактных животных (п=8)

Анешний вид ран в динамике репарации. Примчеание

Рис. 1. Анешний вид ран в динамике репарации. Примчеание: 1-3 сутки - фаза воспалении и образования фибрино-тканевого струпа; 5-7 сутки - фаза регенерации, заполнение дефекта раны грануляционно такныо и появление очагов эпителизации; 9-21 сутки - фаза эпителизации и рост шерстного покрова

оыл определен исходный уровень активности иммунной системы. Функциональную активность клеточных факторов врожденного иммунитета оценивали по способности селезеночных макрофагов к поглощению (ФП, %) инактивированных дрожжевых клеток и метаболизму в спонтанном варианте НСТ-теста (НСТ, %). Активность клеточного иммунитета определяли в реакции гиперчувствителъности замедленного типа (ГЗТ, %) по Crowle. Состояние гуморального иммунитета оценивали по числу ядросодержащих клеток (ЯСК) в селезенке (ХЮ6), антителообразующих клеток в 1 млн. ЯСК (АОК в 1 млн. ЯСК) и АОК во всей селезенке (АОК/сел) по Cunningham.

Все манипуляции с животными проведены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к Приказу М3 СССР №755 от 12.03.1977 г.) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (ETSN № 123, Страсбург, 18 марта 1986 года). Достоверность различий между группами оценивали по t-критерию Стьюдента в программе SPSS «11,5 for Windows».

Результаты и их обсуждение. Визуальное наблюдение (рис. 1) показало, что на следующий день после формирования рапы (1 сутки) у всех животных на раневой поверхности была небольшая гиперемия с легким отеком тканей и присутствие небольшого количества серозно-геморрагического экссудата, который на 2 сутки преобразовался в фибрино-тканевой струп. Отмечено, что у животных из групп с РМО и «тепловыми» метаболитами образовавшаяся на раневой поверхности корочка была значительно тоньше и мягче, чем в других ipyrinax. Вторая стадия процесса репарации развивалась в основном под струпом, а биологическое очищение ран происходило по типу секвестрации и элиминации. Переход второй фазы заживления в третью - фазу эпителизации характеризовался выполнением раны грануляциями, раневой контракцией и началом краевой эпителизации. Между фазами грануляции и эпителизации четкого разделения во времени не выявлено - эпителий нарастал с краев на поверхность грануляционной ткани в виде белесоватой каймы почти одновременно с образованием самой грануляционной ткани. Наиболее четко феномен раневой контракции проявлялся в начале третьей фазы заживления раны.

Появление первых очагов эпителизации в опытных группах отмечено на 2 сутки, а в контролях с плацебо и лекарственным препаратом - на 3 сутки. Первые признаки роста шерсти были отмечены у животных из группы МБ-Т на 7 сутки, на 9 сутки рост шерсти по краю раны наблюдался уже у всех животных в данной группе, в группе с РМО - на 8 сутки, в то время как в остальных группах первые признаки роста шерсти отмечались только на 9 сутки. К 21 суткам в опытных группах с РМО и МБ-Т отмечен хороший шерстный покров и практическое отсутствие рубца. В группе с лекарственным препаратом и МБ-Х шерстный покров был также хороший, рубец был слабо выражен. В группе с плацебо шерстный покров был слабее и рубец более выражен. В ipynrie с плацебо эпители- зация раневой поверхности завершилась на 13 сутки. Под влиянием лекарственного препарата и «холодовых» метаболитов эпителизация раневой поверхности завершилась на 12 сутки (на 8,3% быстрее, чем в контроле с плацебо). Под влиянием РМО эпителизация раневой поверхности завершилась на 11 сутки (на 18,2% быстрее, чем в контроле с плацебо и на 9,1% быстрее, чем в группе с лекарственным препаратом). Под влиянием «тепловых» метаболитов эпителизация раневой поверхности завершилась на 10 сутки (на 30% быстрее, чем под влиянием плацебо, на 20% быстрее, чем под влиянием лекарственного препарата и на 10% быстрее, чем под влиянием РМО). Следует отметить, что под влиянием РМО и МБ-Т 100% эпителизация у большинства животных (80%) произошла на 9 сутки от момента формирования раны. Эти данные свидетельствуют, что наиболее полная органотипическая регенерация произошла под влиянием мазевой композиции, содержащей «тепловые» метаболиты РМО.

Анализ динамики изменения скорости контракции ран (рис. 2) в определенной степени позволил выделить в процессе репарации отдельные фазы. Так, у животных в группе с плацебо эти фазы (в сутках) соотносились друг к другу как 3:4:6 (13); в группе с солкосерилом - 2:4:6 (12); с РМО - 2:3:6 (11); с МБ-Т - 2:2:6 (10); с МБ-Х - 3:3:6 (12). Из данного расчета следует, что фаза воспаления была самой короткой у животных в группах «Солкосерил», РМО и МБ- Т - примерно по 2 суток, в группах с плацебо и «хо-

Скорость контракции ран (%) в динамике репарационного процесса

Рис. 2. Скорость контракции ран (%) в динамике репарационного процесса

Динамика изменения веса тела по сравнению с интактным контролем (%)

Рис. 3. Динамика изменения веса тела по сравнению с интактным контролем (%)

Таблица 1

Долевое (%) участие механизмов отдельных фаз репарации в заживлении раны

Группы

Фаза

воспаления

Фаза

регенерации

Фаза

эпителизации

Контроль

плацебо

23,2±2,3

30,7±2,4

46,1 ±3,8

Солкосерил

16,7±1,7*

33,4±2,3

49,9±3,7

РМО

18,2±1,9*

27,3±2,7

54,5±3,9*

МБ-Т

20,2±2,1

20,2±1,9**

59,6±3,6**

МБ-Х

25,2±2,4

25,3±2,3

49,5±3,3

Примечание: отличие от контроля плацебо * - р<0,05; ** - р<0,01

лодовыми» метаболитами - по 3 суток. Фаза грануляции самой короткой была в группе с «тепловыми» метаболитами - 2 суток, в группах с РМО и «холодовыми» МБ - по 3, а в группах с плацебо и лекарственным препаратом - по 4 суток. Обращает на себя внимание равнозначность времени течения фазы эпителизации во всех группах (около 6 суток), что, во-первых, соотносится с известным фактом постоянства скорости эпителизации, во-вторых, еще раз подчеркивает достаточную стандартность нашей модификации модели формирования кожной раны. Сочетание раневой контракции с интенсивной эпи- телизацией во вторую и третью фазы свидетельствует о нормальном течении раневого процесса.

Расчеты показывают, что использование лекарственного препарата солкосерила существенно (р<0,05) сокращает активность воспалительных процессов относительно контроля плацебо, увеличивая при этом длительность течения фазы грануляции (р>0,05).

Локальное нанесение на рану мази с РМО способствует снижению активности воспалительных процессов (р<0,05) и стимуляции механизмов эпителизации (р<0,05). Отсутствие четкой грани между фазами воспаления и грануляции (рис. 2) при использовании мази с «тепловыми» метаболитами может означать, что активация механизмов грануляции наступила очень быстро, почти одновременно с активацией механизмов воспаления. В результате этого произошло сокращение суммарной длительности течения фаз воспаления и регенерации в группе МБ-Т на 33,4% быстрее, чем группе с плацебо, на 24% быстрее, чем в группах с солко- серилом и «холодовыми» метаболитами и на 12% быстрее, чем под влиянием РМО. Снижение активности воспалительных процессов в группах МБ-Т и РМО сопровождается увеличением активности механизмов эпителизации в группах с «тепловыми» метаболитами до 59,6±3,6% (р=0,01) и РМО до

54,5±3,9% (р=0,05) против 46,1±3,8% в контроле с плацебо, что проявляется формированием к 21 суткам хорошего шерстного покрова и отсутствием рубца. «Холодовые» метаболиты не оказали значимого влияния на механизмы отдельных фаз репарационного процесса.

Проведение лечебных мероприятий на раневой поверхности оказало свое влияние на общие реакции организма на травму, о чем свидетельствуют данные ежедневного измерения веса (рис. 3) и температуры (рис. 4) тела. У животных из контрольной группы с плацебо отмечено достоверное повышение температуры (рис. 4) на 2 сутки (р<0,05) и отсроченное во времени снижение веса тела (рис. 3) на 5-10 сутки после нанесения раны (р<0,05 относительно интактного контроля). Достоверное увеличение веса тела отмечено в группе с использованием «тепловых» метаболитов на 2 и 21 сутки (р<0,05 относительно интактного контроля).

Вычисление суммарной скорости контракции рапы за фазу (например, за 3 дня фазы воспаления) позволило определить долевое участие механизмов отдельных фаз в общем процессе репарации (табл. 1).

Динамика изменения температуры тела по сравнению с интактным

Рис. 4. Динамика изменения температуры тела по сравнению с интактным

контролем (%)

Таблшш 2

Состояние иммунной системы

Показатели

Контроль

интактный

Контроль

плацебо

Контроль

«Солкосерил»

PMO

МБ-Т

МБ-Х

3 сутки

ФП,%

15,0±1,56

25,8i2,13**

24,6il,74**

24,3il,77**

24,lil,8**

24,3i2,21**

НСТ,%

10,3±0,87

23,3il,48**

21,1±1,36**

17,4il,34**

17,6il,53**

20,7il,57**

ГЗТ,%

24,0±1,88

39,5l3,05**

35,612,75**

32,112,97**

31,44i2,32**

33,4i3,33**

АОК/Ю'1

978±Ю6

1144±123

12341136

1545+144**,л

16531121 **,л

12621131

7 сутки

ФП,%

14,2±0,97

17,4il,3*

16,4+1,57

16,7il,55

15,lil,68

17,8il,64*

НСТ,%

9,9±0,73

15,711,3*

13,llO,94AA

12,9ll,llA

12,5i0,98A

13,9i0,91*

ГЗТ,%

24,6±1,5

32,5i3,13*

28,8i2,94

28,5+2,76

27,5i2,45

30,2i3,3*

АОК/Ю6

958±73

1600±113**

17531148**

19231172**,л

21791197**,A

16671172**

14 сутки

ФП,%

14,5±1Д

16,7il,4

15,311,37

15,7+1,48

14,6+1,4

16,3+1,5

НСТ,%

9,4±0,7

12,6il,5*

ll,2il,06

11,6+1,13

9,4il,lA

12,4il,3*

ГЗТ,%

25,2±1,8

27,5i2,l

27,212,16

26,211.93

25,9i2,25

26,7i2,24

АОК/Ю'1

897±82

16161149**

17321163**

164Ш47**

15431163**

14961126**

21 сутки

ФП,%

14,9±1Д

15Д11Д

14,6il,2

14,2il,3

14,3il,3

14,3ll,5

НСТ,%

9,6±0,8

10,6il,l

9,4ll,l

10,2ll,13

10,3i0,83

10,4i0,94

ГЗТ,%

24,7±2Д

25,2i2,2

24,2l2,l

24,4i2,13

24,2i2,36

25,2+2,4

АОК/Ю6

937±77

1330179**

14151117**

14181137**

13521148**

1296187**

Примечание: отличие от интактного контроля * - р=0,05; ** - р=0,01; отличие от контроля плацебо Л - р=0,05; лл - р=0,01

На основании этих данных можно высказать предположение, что локальные лечебные мероприятия на раневой поверхности небольшой площади (55-65 мм2) способны в определенной степени нивелировать проявления стресс-реакции у животных. При этом обращает на себя внимание некоторое повышение веса тела на 2-3 сутки у опытных животных из групп РМО и МБ-Х относительно уровня интактного контроля. Несмотря на статистическую недостоверность, динамика изменения средних величин веса тела может свидетельствовать, что наиболее энергозатратной является фаза грануляции (4-8 сутки), в которую животные потеряли от 2 до 4% своего веса (относительно сверстников из фугшы интактного контроля). Недостаток веса в этих же пределах отмечался у животных и в фазу эпители- зации (8-14 сутки). После 14 суток животные активно набирали вес и к 21 суткам догнали по этому показателю своих здоровых сверстников из группы интактного контроля. Исключение составила группа с «тепловыми» метаболитами - вес животных из этой фугшы уже к 9 сугкам достиг контрольных показателей, а к 21 суткам даже превысил его на 4% (р<0,05). Увеличение веса

тела животных в группе с МБ-Т может свидетельствовать о преобладающем влиянии парасимпатического отдела вегетативной нервной системы, направленного на активизацию процессов регенерации.

Учитывая, что иммунная система помимо цензорной обладает и морфогенетической функцией и активно участвует в восстановлении тканевого гомеостаза, нами проведено исследование ее функциональной активности в динамике репарационного процесса (табл. 2). Выделены как общие, гак и частные проявления иммунореактивности в разные фазы репаративного процесса и влияние на реактивность иммунной системы изучаемых препаратов.

Так, на 3 сутки раневого процесса (фаза воспаления) у животных из всех ipyriri достоверно повышена активность клеточных факторов врожденного иммунитета - поглотительная и метаболическая активность макрофагов (ФП и НСТ) относительно аналогичных показателей у их интактных сверстников. Известно, что макрофаги играют решающую роль именно в первую фазу заживления рапы, так как отвечают за удаление омертвевших клеток путем фагоцитоза и секреции цитокинов, участвующих в процессе репарации. Их активация опосредуется структурами молекул, высвобождаемых при повреждении ткани и/или присутствующих на поверхности микроорганизмов [7.12,13]. Одновременно отмечено повышение функциональной активности клеточного иммунитета (ГЗТ). Сумма этих данных являегся свидетельством активации провоспалительных механизмов иммунной системы, направленных на очищение раневой поверхности от поврежденных тканей.

Огличие между группами в этот период проявляется по активности гуморального иммунитета. В контрольных группах с плацебо и лекарственным препаратом активность гуморального иммунитета (АОК/Ю6) достоверно не изменилась. Обращает на себя внимание достоверное повышение численности активированных потомков В-лимфоцитов (АОК) у животных из групп с РМО и МБ-Т. Причем в группе с РМО уровень АОК в этот период достоверно превышает этот показатель во всех контрольных группах (КИ, КП и КС), в группе с МБ-Т - относительно интактного контроля и плацебо. На этом фоне отмечено менее выраженное повышение функциональной активности макрофагов (НСТ) и клеточного иммунитета (ГЗТ) в группе с «тепловыми» метаболитами.

Эти данные могут свидетельствовать о быстром или даже одновременном включении в группах с РМО и МБ-Т иммунных механизмов с противовоспалительной активностью, что в определенной степени сочетается с умеренным повышением массы тела животных в данный период (рис. 3).

На 7 сутки раневого процесса (фаза пролиферации) общим для всех животных является, с одной стороны, снижение функциональной активности клеточного иммунитета, поглотительной и метаболической активности макрофагов относительно предыдущей фазы (3 суток), с другой - отмечено значимое повышение функциональной активности гуморального иммунитета. При этом относительно интактного контроля метаболическая активность макрофагов сохраняется на повышенном уровне, что, в определенной степени, согласуется с известными данными о функциональной дихотомии макрофагов в разные фазы репаративного процесса как эффекторов повреждения тканей и ремонта [6,7,12]. Эти данные могут свидетельствовать об активации противовоспалительных механизмов иммунной системы в фазу грануляции, направленных на восстановление нарушенного гомеостаза. Обращает на себя внимание факт сохранения на повышенном уровне активности клеточного иммунитета, поглотительной и метаболической активности макрофагов у животных из групп с плацебо и «холодовыми» метаболитами относительно интактного контроля, что может свидетельствовать о медленном переключении провоспалительных механизмов на противовоспалительные. Учитывая, что провоспали- гельпые механизмы являются наиболее энергозатратными, становится объяснимым достоверное снижение веса тела у этих животных к 5 суткам репарационного процесса (рис. 3).

На 14 сутки процесса репарации (фаза эпителиза- ции) общность реакций иммунной системы вне зависимости от особенностей лечебных препаратов проявилась относительной нормализацией поглотительной активности макрофагов и активности клеточного иммунитета, заметным снижением метаболической активности макрофагов относительно предыдущей фазы (7 сутки), а также сохранением на повышенном уровне активности гуморального иммунитета относительно интактного контроля. Некоторое отличие между группами отмечается по метаболической активности макрофагов: в группах с плацебо и «холодовыми» метаболитами она сохранилась на повышенном уровне относительно интактного контроля, а в группе с «тепловыми» метаболитами восстановилась до контрольных значений. Значимое снижение активности провоспалительных механизмов иммунной системы отразилось на общих реакциях организма - средние показатели веса тела стали приближаться к контрольному уровню, а в группе с «тепловыми» метаболитами даже превысили его (рис. 3).

К 21 суткам во всех группах отмечено восстановление до контрольных значений показателей поглотительной, метаболической активности макрофагов и функциональной активности клеточного иммунитета, сохранение на повышенном уровне активности гуморального иммунитета.

Таким образом, проведенное исследование позволило установить наличие высокого репаративного потенциала у ископаемых бактерий штамма MG8 Bacillus sp., выделенных из проб реликтовой мерзлоты, и продуктов их жизнедеятельности - метаболитов, который они могут делегировать другим живым системам. Способность к регуляции репаративных процессов в макроорганизме проявляется у ископаемых бактерий в относительно небольших дозах - меньше 20><103 м.кл. и локальном нанесении на раневую поверхность. Явным лидером модуляции репаративных процессов при заживлении дефектов кожи являются «тепловые» метаболиты, полученные при культивировании бактерий при 37°С. При локальном нанесении на рану мази с «тепловыми» метаболитами процесс репарации ускоряется на 30% относительно плацебо, на 20% относительно лекарственного препарата «Солкосерил» и «холодовых» метаболитов и на 10% быстрее, чем под влиянием самих бактерий (РМО).

Сам процесс регенерации кожи под влиянием как бактерий, так и их метаболитов характеризуется этагшостью, подтверждающей детерминированность тканево- и органотипической дифферепцировки компонентов кожи эктодермального и мезенхимного ге- неза. Динамика эпидермальных формообразовательных процессов при заживлении дефекта кожи под влиянием изученных препаратов коррелирует с динамикой активности иммунной системы. Последовательность изменения активности различных звеньев иммунной системы (клеточные факторы врожденной иммунорезистентности - клеточный иммунитет - гуморальный иммунитет) соответствует этапности развития репарационного процесса (повреждение - воспаление - восстановление). Механизмы рефляции репарационным процессом у иммунной системой соответствуют общим закономерностям регуляции воспалительного процесса и изменяются волнообразно: преимущественное повышение активности провоспалительных механизмов сменяется преимущественным повышением активности противоспалитель- ных механизмов иммунной системы.

Использование «тепловых» метаболитов ископаемых бактерий способствует оптимизации регенераторного процесса, сокращению времени контракции раны, уменьшению образования рубцовой ткани, более полноценному восстановлению шерстного покрова на основании чего их можно отнести к модуляторам раневого процесса с преобладанием механизмов регенерации [9]. Возможными механизмами выраженного сокращения длительности течения фаз воспаления и грануляции и более полноценной органотипической регенерации кожной ткани под влиянием «тепловых» метаболитов могут быть селективная стимуляция иммунокомпетентных клеток к секреции лимфокинов, цитокинов и факторов роста с противовоспалительной направленностью адаптивного ответа, непосредственная активация масто- базофильной системы и индукция к пролиферации эндотелия капилляров и фибробластов [6,14,15]. Возможность влияния метаболитов ископаемых бактерий непосредственно на процессы пролиферации косвенно подтверждается данными ранее проведенных нами исследований на клетках периферической крови человека in vitro, в которых была установлена высокая лимфопролиферативная активность у метаболитов РМО.

Дальнейшее изучение действия препаратов с РМО и их метаболитами может позволить отобрать наиболее эффективные в терапевтическом плане и предложить принципиально новые пути для стимуляции восстановительных процессов при репарации поврежденных тканей.

Выводы:

  • 1. Ископаемые бактерии штамма MG8 Bacillus sp. увеличивают скорость эпителизации раневой поверхности на 18,2% относительно контроля с плацебо и на 9,1% относительно группы с лекарственным препаратом «Солкосерил».
  • 2. Метаболиты штамма MG8 Bacillus sp., полученные при культивировании бактерий при 37°С, способствуют оптимизации регенераторного процесса, сокращению времени контракции раны на 30% относительно плацебо и на 20% относительно лекарственного препарата «Солкосерил», уменьшению образования рубцовой ткани и более полноценному восстановлению шерстного покрова
  • 3. Последовательность изменения активности различных звеньев иммунной системы (клеточные факторы врожденной иммунорезистентности - клеточный иммунитет - гуморальный иммунитет) соответствует этапности развития репарационного процесса (повреждение - воспаление - восстановление).

Литература

  • 1. Белова О.В., Арион В.Я. Иммунологическая функция кожи и нейроиммунокожная система // Аллергология и иммунология. 2006. Т. 7. № 4. С. 492-497.
  • 2. Брушков А.В., Мельников В.П., Щелчкова В.П., Грива Г.И., Репин В.Е., Бреннер Е.В., Танака Е.В. Биогеохимия мерзлых пород Центральной Якутии // Криосфера Земли. 2011. Т. XY. № 4. С. 90-100.
  • 3. Катунина О.Р., Резайкина А.В. Современные представления об участии кожи в иммунных процессах // Вести, дерматол. и венерол. 2009. № 2. С. 39-46.
  • 4. Тухбатова Р.И., Абдельрахман А.А., Мухамет- зянова А.С., Нгуен Т.Т., Хоанг Т.Т., Фаттахова А.Н., Алимова Ф.К. Влияние метаболитов Trichoderma asperellum на регенерацию тканей на фоне пирена //

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2012. Т. VII. № 3. С. 159-163.

  • 5. Шульга Е.А., Грозеску Е.А., Бахарева А.А. Лечебные свойства пробиотика «Субтилис» при репарации кожных покровов осетровых рыб // Вестник АГТУ. Серия: Рыбное хозяйство. 2009. №1. С. 86-89.
  • 6. Barrientos S., Stojadinovic О., Golinko M.S., Brem Н., Tomic-Canic М. Growth factors and cytokines in wound healing // Wound Repair Regen. 2008. Vol. 16. № 5. P. 585-601.
  • 7. Brancato S.K., Albina J.E. Wound macrophages as key regulators of repair: origin, phenotype, and function // Am. J. Pathol. 2011. Vol. 178. № 1. P. 19-25.
  • 8. Wilgus T.A. Immune cells in the healing skin wound: influential players at each stage of repair // Pharmacol. Res. 2008. Vol. 58. № 2. P. 112-116.
  • 9. Gurtner G.C., Werner S., Barrandon Y., Longak- er M.T. Wound repair and regeneration // Nature. 2008. Vol. 453. № 7193. P. 314-321.
  • 10. Kalenova L.F., Suhovey U.G., Broushkov A.V., Melnikov V.P., Fisher T.A., Besedin I.M., Novikova M.A., Efimova J.A., Subbotin A.M. Experimental study of the effects of permafrost microorganisms on the mor- phofunctional activity of the immune system // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2011. Vol. 151. № 2. P. 201-204.
  • 11. Kalenova L.F., Suhovey U.G., Broushkov A.V., Melnikov V.P., Fisher T.A., Besedin I.M., Novikova M.A., Efimova J.A. Effects of permafrost microorganisms on the quality and duration of life of laboratory animals // Neuroscience and Behavioral Physiology. 2011. Vol. 41. № 5. P. 484-490.
  • 12. Lucas T., Waisman A., Ranjan R., Roes J., Krieg T., Mtiller W., Roers A., Eming SA. Differential roles of macrophages in diverse phases of skin repair // J Immunol. 2010. Vol. 184. № 7. C. 3964-3977.
  • 13. Mahdavian Delavary B., van der Veer W.M., van Egmond M., Niessen F.B., Beelen R.H. Macrophages in skin injury and repair // Immunobiology. 2011. Vol. 216. № 7. P. 753-762.
  • 14. Park J.E., Barbul A. Understanding the role of immune regulation in wound healing // Am J. Surg. 2004. № 187. P. 11-16.
  • 15. Rodero M.P., Khosrotehrani K. Skin wound healing modulation by macrophages // Tnt. J. Clin. Exp. Pathol. 2010. Vol. 3. № 7. C. 643-653.
  • 16. Sato T., Yamamoto M., Shimosato T., Klinman D.M. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9 // Wound Repair Regen. 2010. Vol. 18. № 6. P. 586-593.

References

  • 1. Belova OV, Arion VYa. Immunologicheskaya funktsiya kozhi i neyroimmunokozhnaya sistema. Al- lergologiya i immunologiya. 2006;7(4):492-7. Russian.
  • 2. Brushkov AV, Mel'nikov VP, Shchelchkova VP, Griva GI, Repin VE, Brenner EV, Tanaka EV. Biogeokhimiya merzlykh porod Tsentral'noy Yakutii. Kriosfera Zemli. 2011;XY(4):90-100. Russian.
  • 3. Katunina OR, Rezaykina AV. Sovremennye predstavleniya ob uchastii kozhi v immunnykh protses- sakh. Vestn. dermatol. i venerol. 2009;2:39-46. Russian.
  • 4. Tukhbatova RI, Abdel'rakhman AA, Mukhamet- zyanova AS, Nguen TT, Khoang TT, Fattakhova AN, Alimova FK. Vliyanie metabolitov Trichoderma asperel- lum na regeneratsiyu tkaney na fone pirena. Kletoch- naya transplantologiya i tkanevaya inzheneriya. 2012;VII(3):159-63. Russian.
  • 5. Shul'ga EA, Grozesku EA, Bakhareva AA. Le- chebnye svoystva probiotika «Subtilis» pri reparatsii kozhnykh pokrovov osetrovykh ryb. Vestnik AGTU. Seriya: Rybnoe khozyaystvo. 2009;1:86-9. Russian.
  • 6. Barrientos S., Stojadinovic O., Golinko M.S., Brem H., Tomic-Canic M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound Repair Regen. 2008;16(5):585-601.
  • 7. Brancato SK, Albina JE. Wound macrophages as key regulators of repair: origin, phenotype, and function. Am. J. Pathol. 2011;178(l):19-25.
  • 8. Wilgus ТА. Immune cells in the healing skin wound: influential players at each stage of repair. Pharmacol. Res. 2008;58(2):112-6.
  • 9. Gurtner GC, Werner S, Barrandon Y, Longaker MT. Wound repair and regeneration. Nature. 2008;453(7193):314-21.
  • 10. Kalenova LF, Suhovey UG, Broushkov AV,

Melnikov VP, Fisher ТА, Besedin IM, Novikova MA, Efimova JA, Subbotin AM. Experimental study of the effects of permafrost microorganisms on the morpho- functional activity of the immune system. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2011;151(2):201-4.

  • 11. Kalenova LF, Suhovey UG, Broushkov AV, Melnikov VP, Fisher ТА, Besedin IM, Novikova MA, Efimova JA. Effects of permafrost microorganisms on the quality and duration of life of laboratory animals. Neuroscience and Behavioral Physiology. 2011;41(5):484- 90.
  • 12. Lucas T, Waisman A, Ranjan R, Roes J, Krieg T, Mtiller W, Roers A, Eming SA. Differential roles of macrophages in diverse phases of skin repair. J Immunol. 2010;184(7):3964-77.
  • 13. Mahdavian Delavary B, van der Veer WM, van Egmond M, Niessen FB, Beelen RH. Macrophages in skin injury and repair. Immunobiology. 2011;216(7):753-62.
  • 14. Park JE, Barbul A. Understanding the role of immune regulation in wound healing. Am J. Surg. 2004;187:11-6.
  • 15. Rodero MP, Khosrotehrani K. Skin wound healing modulation by macrophages. Tnt. J. Clin. Exp. Pathol. 2010;3(7):643-53.
  • 16. Sato T, Yamamoto M, Shimosato T, Klinman DM. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9. Wound Repair Regen. 2010;18(6):586-93.

УДК: 616.72-018.3 DOI: 10.12737/7270

 
<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>