Полная версия

Главная arrow Агропромышленность arrow Воспроизводство сельскохозяйственной птицы

  • Увеличить шрифт
  • Уменьшить шрифт


<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>

Модификации методов с использованием ПЦР

Полимеразная цепная реакция с использованием обратной транскриптазы.

Технология применяется для идентификации РНК вирусов. Простая ПЦР непригодна для идентификации рибонуклеиновых кислот, так как ДНК-зависимая ДНК-полимераза не способна катализировать синтез ДНК на матрице РНК. Этих целей достигают несколькими приемами:

  • 1) применяют дополнительный фермент — РНК-зависимую ДНК-полимеразу, обратную транскриптазу. В результате реакции, катализируемой этим ферментом, образуются однонитевые фрагменты ДНК, которые в дальнейшем используются в амплификации с помощью Год-полимеразы;
  • 2) применяют ДНК-зависимую ДНК-полимеразу, выделенную из другого термофильного микроба Thermus thermophilic (7У/г-полиме- разы), с помощью которой в присутствии ионов марганца можно катализировать синтез на PH К однонитевой комплементарной ДНК. При последующем добавлении в среду ионов магния и хелаторов ионов марганца этот же фермент катализирует обычную ДНК-зави- симую ДНК-полимеразную реакцию. Таким образом, он может быть одновременно использован и для синтеза комплементарных одно- нитевых фрагментов ДНК, и для амплификации ДНК.

Мулътипраймерная ПЦР. В ходе мультипраймерной ПЦР процесс коамплификации нескольких матриц ДНК происходит в одной реакционной среде с несколькими парами праймеров (рис. 2.8). Это позволяет одновременно провести, например, скрининг по нескольким возбудителям инфекционных болезней, исследовать состояние нескольких аллельных генов у эукариотических организмов, в том числе и у человека.

Гнездовая ПЦР. Это модификация ПЦР, при которой используют две пары праймеров, одна из которых участвует в амплификации внутреннего участка ампликона, полученного после предваритель-

Возможность автоматизации ПЦР-анализа

Рис. 2.8. Возможность автоматизации ПЦР-анализа

ного цикла амплификации с внешней парой праймеров. В ходе данной ПЦР необходимо перенести ампликон на определенном этапе из одной пробирки в другую, что может привести к появлению ложноположительных результатов. Вместе с тем этот вариант ПЦР характеризуется высокой чувствительностью.

ПЦР in situ. Данный метод позволяет специфически амплифици- ровать и локализовать какую-либо последовательность ДНК внутри клетки. Внутриклеточное обнаружение продуктов ПЦР можно выполнять через непрямую гибридизацию in situ или без того этапа с прямой детекцией меченых нуклеотидов. При непрямой П ЦР in situ после проведения амплификации и гибридизации ПЦР-продукт взаимодействует с пробой, меченной флюорохромом. При прямой детекции меченые нуклеотиды (например, дигоксигенин—11-дУТФ, флюоресцеин-дУТФ) включаются непосредственно в состав ампли- фицируемого продукта.

Метод неоценим при исследовании вирусных инфекций и экспрессии генов в клетке, а также при определнии эффекта действия новых лекарственных средств на клеточном и молекулярном уровнях.

Количественная ПЦР. При проведении количественной ПЦР простым подходом является использование внутренних стандартов, которые, как и определяемая ДНК, участвуют в ПЦР. Используя сбавленные внутренние стандарты с разным количеством копий, можно определить количество копий матрицы, участвующей в реакции. Такой внутренний контроль позволяет:

  • • выявить возможное снижение активности реакции ингибиторами, содержащимися в исследуемом образце;
  • • учесть эффект неравномерности протекания реакции, так как условия амплификации стандарта и определяемой ДНК или РНК идентичны;
  • • в значительной степени абстрагироваться от изучения закономерностей протекания реакции, так как основным алгоритмом расчета конечного результата является совпадение сигнала от внутреннего контроля — стандарта и сигнала от определяемого ампл икона.

ПЦР в реальном времени. Наиболее технологичным подходом в создании количественного метода является ПЦР в реальном времени. Характерная черта этого метода — возможность прямого определения продуктов реакции непосредственно в процессе исследований, для чего используют прибор, показанный на рис. 2.9. Характеристики этого прибора:

  • • источник излучения: галогеновая лампа;
  • • светофильтры: 5 пар фильтров — 5 каналов детекции (4 для мультиплекса) (Filter set 4: 490/530нм, 530/575, 545/585, 575/620, 635/680 нм);

Рис. 2.9. Прибор для real-time PCR

  • • детектирующее устройство: CCD-камера;
  • • термоциклирование: элементы Пелтье;
  • • емкость реакционного модуля: 96-луночная плашка или 96 пробирок х 0,2 ml.
 
<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>