АНАЛИЗ РЕАЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ
Результаты применения ИК-спектрометрии в фармацевтическом анализе
Рассмотрены алгоритмы идентификации лекарственных субстанций и препаратов по производителям при случайной выборке, а также методики для выявления контрафактной продукции. Все представленные результаты - итог статистической обработки впервые созданных библиотек БИК-спектров, включающих 42 лекарственных субстанции и 355 наименований готовых лекарственных форм. Представленные примеры демонстрируют возможность идентификации фальсификатов и повышение уровня оценки качества фармацевтической продукции на основании дополнительной аналитической информации, ранее недоступной при использовании традиционных методов контроля.
Идентификация производителя лекарственной субстанции
Фармацевтические субстанции по традиции часто продолжают рассматриваться как одна из разновидностей лекарственных средств, что соответствует законодательству многих стран. В практическом же плане субстанции относятся к категории сырья для промышленного изготовления фармацевтических продуктов - лекарственных препаратов в готовых (дозированных) формах. Это нашло отражение в терминологии - во многих нормативных и методических документах субстанции стали именоваться «активными ингредиентами».
Основная доля ответственности за выбор надлежащих исходных веществ и за проверку их качества возлагается на производителей готовых продуктов. Производители фармацевтических препаратов проводят углубленное сравнительное изучение химических и физических свойств, а так же технологических параметров (профиль примесей, полиморфизм, гранулометрический состав, характер кристаллов, сыпучесть, насыпной вес и др.) субстанций различного происхождения и градаций. По результатам этих исследований и с учетом последующих технологических разработок составляются внутренние спецификации качества для исходных материалов и выбираются их поставщики.
Известно, что свойства субстанций даже одного производителя отличаются по многим технологическим и некоторым физико-химическим показателям, контроль которых не предусмотрен фармакопеями ведущих стран или стандартами фирмы. Некоторые компании выпускают по нескольку «сортов» субстанций одного вида, и эти сведения не всегда известны закупающим предприятиям, несмотря на то, что использование разных субстанций потребует корректировки технологического процесса изготовления из них лекарственной формы. Таким образом, для фармацевтической практики представляет интерес поиск таких методов, которые позволили бы отличить продукцию различных производителей и отдельных серий каждого производителя. Для этих целей - контроля качества и доказательства идентичности субстанций - метод БИК-спектрометрии не имеет конкурентов.
На примере лекарственных субстанций ампициллина натриевой соли, ампициллина тригидрата, цефазолина натриевой соли, цефотак- сима натриевой соли, цефтриаксона натриевой соли, метамизола натрия и таурина было показано, что в БИК-области могут быть выявлены спектральные различия между лекарственными субстанциями одного наименования различных производителей. Исследования проводили на БИК-спектрометрах, отличающихся программным обеспечением и формой итоговых результатов, - «ANTARIS II», Thermo Scientific (США) и «Multi Purpose Analyzer», BRUKER Optik GmbH (Германия). Применение в исследованиях приборов разных фирм позволило расширить сведения о возможностях хемометрической обработки спектральных данных и представления результатов анализа разными типами программного обеспечения БИК-спектрометров.
Первоначально была предпринята попытка извлечь информацию из первичных БИК-спектров нескольких субстанций лекарственных средств, как это происходит при интерпретации ИК-спектров в средней области. Традиционный подход позволил накопить экспериментальную информацию и сделать ряд предварительных заключений по первичным БИК-спектрам для субстанций нескольких серий разных производителей: ампициллина натрия (3 производителя), ампициллина тригидрата (2 производителя), цефазолина натриевой соли (3 производителя), цефо- таксима натриевой соли (2 производителя).
Для работы использовался БИК-спектрометр «Multi Purpose Analyzer» («BRUKER Optik GmbH», Германия). Перед снятием спектра для исключения влияния диоксида углерода и воды предварительно снимали фоновый спектр воздуха. Для каждой пробы снимали не менее 9 спектров и, используя программное обеспечение прибора, генерировали средний спектр. Оптимальные условия измерения подбирали с учетом соотношения сигнал - шум и минимального времени записи одного спектра. Число сканов равнялось 32. На получение одного спектра требовалось в среднем около 25 с.
Рис. 5.1. БИК-спектры субстанции цефазолина натриевой соли трех производителей
В спектре цефазолина натриевой соли (рис. 5.1) достаточно информативны следующие участки: полоса в области 8500 см-1 относится ко второму обертону валентного колебания СН3-группы; широкая полоса при 7000 см 1 отражает первый обертон смешения СН-, СН2- и СН3-групп, область 5750 см 1 - первый обертон СН-группы; область5220 см4 - первый обертон группы CONH2.
Как и ожидалось, рассмотренные БИК-спектры не позволили выявить различия между субстанциями отдельных производителей. Это оказалось возможным только после обработки спектров методами математической статистики. Для этого проводили генерирование стандартных спектров исследуемых субстанций. Стандартный (библиотечный, «опорный») спектр субстанции получали усреднением множества спектров, снятых для нескольких ее качественных серий при многократных повторностях.
Хемометрическая обработка спектров методом главных компонент (МГК, Principal Component) в рамках возможностей программного обеспечения спектрометра MPA, BRUKER позволила перенести спектральные результаты в систему координат X, Y и представить их в виде областей скопления точек. Каждая точка на модифицированном спектре соответствовала в пространстве спектру отдельной субстанции. В трехмерном пространстве, где координатные оси - это векторы главных компонент (ГК), точки группируются в области. Главную компоненту следует рассматривать как направление наибольшего изменения в пространстве переменной X или Y. Таким образом, совокупности близлежащих точек одной группы объединяются в общую область - эллипсоид или сферу. Как оказалось, группы точек или занимаемые ими сфериче- ские/эллипсоидные пространства соответствуют образцам субстанций разных производителей.
Аналогичные результаты были получены и для субстанций це- фтриаксона натриевой соли (3 производителя), метамизола натрия (2 производителя) и таурина (2 производителя) при анализе их на БИК- спектрометре «ANTARIS II». Измерения также проводили в режиме диффузного отражения с использованием интегрирующей сферы. Для каждой пробы снимали не менее 9 спектров. Число сканов равнялось 16, разрешение - 4 см-1.
Как и при работе на БИК-спектрометре фирмы BRUKER, исходные спектры исследуемых субстанций практически не отличались по числу полос и их частотному расположению, но по величине абсорбции имели заметные различия. Тем не менее полученная спектральная картина не позволила разработать алгоритм для отличия субстанций разного происхождения. Последующая статистическая обработка спектральных результатов дала иной результат, характеризующийся высокой информативностью.
Как и в случае исследования субстанции таурина, при ИК-спек- тральном анализе в ближнем диапазоне лекарственной субстанции метамизола натрия в координатах Махаланобиса были обнаружены статистически достоверные различия между двумя классами, соответствующими двум производителям (рис. 5.2).
Рис. 5.2. Статистическое разделение образцов субстанции метамизола натрия в координатах махаланобиса:
квадраты - субстанции Shandog Xinhua Pharmaceutical Company, Китай; треугольники - субстанции Wuhan Pharmaceutical Factory, Китай
Значения расстояний между выделенными классами менее трех единиц Махаланобиса свидетельствуют об отсутствии достоверных различий между образцами субстанций двух производителей. Субстанции идентичны и по своей химической природе, представляют собой метамизол натрия. Тем не менее графическое разделение результатов на два класса позволяет судить о качественных различиях образцов двух производителей, что может быть использовано для идентификации источника анализируемой субстанции.
Дискриминантный анализ результатов показал, что различия между всеми тремя классами превышают три единицы Махаланобиса. Особенно значительны различия между субстанциями Orchid Chemicals & Pharmaceuticals Ltd, Индия, и Harbin Pharmaceutical Group Со, Китай. Они составляют 5-7 единиц Махаланобиса. Таким образом, выявлено, что исследованные лекарственные субстанции представляют собой качественно разные образцы, хотя нормативные методы не позволили выявить различий между ними.
Таким образом, в результате сравнительного анализа большой выборки БИК-спектров лекарственных субстанций были созданы спектральные библиотеки по 13 производителям. Метод сравнения в рамках дискриминантного и кластерного анализа позволил провести оценку спектральных различий (координаты Махаланобиса) в выпускаемой ими продукции. Впервые были продемонстрированы особенности качества субстанций, не идентифицируемые существующими нормативными методами. Спектральные различия между субстанциями одного наименования могут быть обусловлены расхождениями в технологии получения, а значит, присутствием примесей различной природы. Разная степень очистки субстанций, присутствие влаги, нахождение активного вещества в том или ином фазовом состоянии (полиморфизм), разная степень дисперсности, длительность хранения субстанции при неидентичных параметрах - некоторые из возможных причин наблюдаемых различий.
Создание спектральной библиотеки позволяет в дальнейшем использовать ее для идентификации производителя. Приведенные ниже примеры доказывают возможность идентификации неизвестного производителя субстанций методом дискриминантного анализа с использованием накопленной базы БИК-спектров для одного наименования субстанции разных производителей.
Для решения поставленной задачи были использованы уже ранее классифицируемые БИК-спектры субстанции цефазолина натриевой соли стерильной от двух производителей - Harbin Pharmaceutical Group Со, Китай и Aurobindo Pharma Ltd, Индия. БИК-спектры 12 серий производителя Harbin Pharmaceutical Group Со были разделены на две группы по 6 серий в каждой. Первой группе из шести серий был присвоен статус тестируемого класса. Субстанция другого производителя Aurobindo Pharma Ltd была представлена 5 заводскими сериями. Было прогнозировано, что при анализе спектры тестируемого класса и «опорного» класса, куда вошли оставшиеся серии производителя Harbin Pharmaceutical Group, должны занять одну и ту же область в координатах Махал аноби- са. Как следует из полученных результатов, спектры лекарственных субстанций производства Aurobindo Pharma Ltd, Индия (квадраты), занимают отдельную область в левом верхнем углу графика. Спектры тестируемого и опорного классов (Harbin Pharmaceutical Group Со), как и следовало ожидать, расположены в одной области - в правом нижнем углу графика. Спектральная дистанция между спектрами разных производителей, выражающаяся по оси X и Y в единицах Махаланобиса, составляла от 2,1 до 3,3. Спектральное расстояние между тестируемым и опорным классами не превышало 0,4-1,0 единицы Махаланобиса.
Разработанные алгоритмы определения производителя на базе созданной спектральной библиотеки позволили осуществить идентификацию одной из субстанций цефазолина натриевой соли «вслепую», не зная ее производителя. Идентификацию исследуемой субстанции не удалось провести по совпадению с существующей библиотекой спектров, что свидетельствовало о принадлежности субстанции «неизвестному» производителю, пока не включенному в банк спектральных данных. Действительно, в спектральной библиотеке ближайшим классом по производителю оказался «Харбин фармасьютикал труп», и он находился на расстоянии 17,5 единицы Махаланобиса от исследуемой субстанции. Раскрытие «неизвестного» производителя цефазолина натриевой соли подтвердило правильность выбранной нами модели- субстанция принадлежала компании «G. Amphray Laboratories», Индия, и пока не входила в имеющуюся спектральную библиотеку.
Таким образом, приведенные экспериментальные данные по идентификации производителей продемонстрировали исключительную возможность метода БИК-спектроскопии при использовании группировоч- ных статистических методов обработки спектров провести как разделение спектров на группы производителей, так и определить неизвестного производителя субстанции по принадлежности к группе производителей, внесенных в спектральную базу.
