Полная версия

Главная arrow Агропромышленность arrow Гистология и основы эмбриологии

  • Увеличить шрифт
  • Уменьшить шрифт


<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ФИКСИРОВАННЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

Объектами исследования могут служить фиксированные (мертвые) или живые клетки и ткани.

Для исследования микроструктуры сырья и продуктов животноводства, как правило, используют фиксированные клетки и ткани. Препараты бывают временными, предназначенными для однократного изучения, и постоянными, которые можно сохранять и многократно исследовать. Кроме того, используют тотальные или целостные препараты.

Временные препараты можно приготовить сравнительно быстро; для этого исследуемый материал фиксируют и получают срезы на замораживающем микротоме, при его отсутствии можно сделать тоненький срез ткани или органа скальпелем или лезвием. Полученный срез окрашивают, помещают на предметное стекло, а затем наносят каплю глицерина и накрывают покровным стеклом. Для выявления крахмала используют раствор иода в йодистом калии: в небольшом количестве воды растворяют 0,5 г йодистого калия, вносят 1 г кристаллического иода и добавляют воды до 100 см3. На тоненький кусочек колбасы, сыра и другого материала, расположенный на предметном стекле, наносят несколько капель реактива, крахмал окрашивается в сине-фиолетовый цвет.

Тотальные или целостные препараты исследуют без получения среза ткани или органа. Например, пленку подкожной клетчатки или раздавленный препарат корешка растений после фиксации, промывки и окраски заключают между предметным и покровным стеклами. Для выявления отдельных структурных элементов фиксированные и окрашенные кусочки подкожной клетчатки или гладкой мышечной ткани расщипывают иглой на предметном стекле — такие препараты называют расщипанными. В ряде случаев, например исследуя пленку сетчатки глазного яблока или кожу головастика, после фиксации и промывки окраску не производят, так как в клетках имеются органические включения (пигмент), имеющие естественную окраску.

Методика подготовки гистологического препарата. Основным методом изучения фиксированных клеток и тканей является гистологический, т.е. исследование окрашенного среза ткани, заключенного в специальную среду. Для получения срезов используют заливку исследуемого материала в парафин или целлоидин, что позволяет получать тонкие срезы (5—7 мкм или 10—30 мкм соответственно), для быстрого приготовления срезов (40—60 мкм) используют замораживающую технику.

Основные этапы подготовки гистологического препарата: отбор проб, фиксация, промывка, обезвоживание, заливка в парафин или целлоидин, окрашивание, заключение под покровное стекло.

Отбор проб производится с учетом цели исследования и структуры материала. Размер пробы должен в среднем не превышать 2,5—3,0 см. Пробы печени, селезенки берут с капсулой. Из сердца вырезают кусочки предсердия, так как оболочки тоньше, чем в желудочках и на одном препарате можно видеть топографическое отношение эпикарда, миокарда и эндокарда. Из почек, лимфатических узлов, надпочечников вырезают участки органов, идущие вглубь перпендикулярно поверхности так, чтобы на препарате выявлялись корковое и мозговое вещество. При необходимости приготовить препараты измененных органов кусочки исследуемого материала вырезают на границе с пораженным участком, чтобы в пробу попала зона перехода очага поражения. Из скелетной мускулатуры пробы следует вырезать так, чтобы мышечные волокна были в продольном и поперечном сечении. Пробы образцов фарша, творога и других рассыпающихся образцов предварительно помещают в кусочек марли и перевязывают ниткой. Следует учитывать, что при вскрытии грудной полости легкие вследствие эластичности спадаются, значительно теряя воздушность, поэтому в трахею извлеченных дыхательных органов вставляют стеклянную или резиновую трубку, через которую умеренно вводят воздух. На трахею ниже вставленной трубки накладывают шелковую лигатуру, для полного погружения привязывают груз. Для фиксации кишечника предварительно перевязывают лигатурами с двух сторон участок органа, предназначенного для фиксации. Пробы снабжают этикетками из плотной бумаги с обозначением номера и даты отбора пробы.

Фиксация, т.е. сохранение естественной (прижизненной) архитектоники, проводится с целью перевести живую протоплазму структур в неизменяемое состояние. Действие фиксаторов проявляется в том, что в тканях и органах в результате биофизических процессов происходит необратимая коагуляция белков. Взятый из органа образец ткани как можно быстрее погружают в фиксатор; соотношение объема материала и фиксирующей жидкости должно быть не менее 1:9 (рис. 3).

Фиксация приводит к некоторому уплотнению и уменьшению объема образца. Чаще всего для фиксации используют 10—12%-ный формалин, этиловый спирт, ацетон. Для приготовления указанной концентрации фиксирующей жидкости 40%-ный формалин разбавляют водопроводной водой. Этиловый спирт (100%-ный абсолютный, или 96%-ный) применяют в тех случаях, когда нужно в срезах выявить вещества, растворяющиеся в водных фиксаторах (например, гликоген). В ацетоне исследуемый материал (например, головной мозг) фиксируют всего несколько часов. Когда в исследуемом органе, например костной ткани, содержится известь, проводится декальцинация или обызвествление. Для этого небольшой кусочек кости опускают (лучше подвесить на нитке) в 5—8%-ный водный раствор азотной кислоты, который за сутки меняют 2—3 раза. О результате декальцинации судят, вкалывая тонкую иглу в кость: если нет сопротивления — декальцинация закончена. После такой про-

[18]. Отбор пробы, фиксация и маркировка легкого и кишечника цедуры кусочек тщательно промывают в проточной или часто сменяемой воде, а затем опускают в 12%-ный раствор формалина на 24-48 ч

Рис. 3 [18]. Отбор пробы, фиксация и маркировка легкого и кишечника цедуры кусочек тщательно промывают в проточной или часто сменяемой воде, а затем опускают в 12%-ный раствор формалина на 24-48 ч.

Промывка проводится для удаления излишнего количества фиксатора, например после фиксации формалином промывку проводят проточной водопроводной водой.

Обезвоживание проводят для уплотнения материала в этиловом спирте восходящей концентрации: 50-70—100. Для приготовления 50%-ного и 70%-ного спирта 96%-ный спирт разбавляют дистиллированной водой. Чтобы приготовить 100%-ный спирт, необходимо медный купорос накалить до полного обезвоживания и в обезвоженный порошок белого цвета добавить 96%-ный этиловый спирт. В каждой концентрации спирта материал держат 1—24 ч в зависимости от величины кусочков, строения органа; в 70%-ном спирте материал можно держать в течение нескольких суток.

Заливка проводится такой средой, чтобы исследуемый образец стал твердым, что позволяет получать тонкие срезы. Для этого используют парафин (пропитка 1—4 ч), целлоидин (пропитка три недели). При выявлении жиров и для исследования рыхлых тканей и органов используют заливку в желатин.

Срезы получают на санных или ротационных микротомах. Наиболее тонкие срезы (5—7 мкм) удается изготовить из материала, залитого в парафин. Из материала, залитого целлоидином, готовят срезы толщиной 15—20 мкм. Для исследования микроструктуры сырья и продуктов животного происхождения, как правило, используют замораживающую технику. Это ускоряет изготовление препарата, так как исключаются длительные этапы обезвоживания и заливки. После фиксации и промывки кусочки объекта помещают на влажный предметный столик замораживающего микротома и получают срезы толщиной 40-60 мкм. Срезы переносят кисточкой в воду, где они расправляются, приобретая вид тончайших сероватых лоскутков.

Окрашивание срезов проводят для увеличения контрастности различных структур в препаратах, предназначенных для исследования в световом микроскопе. В процессе окрашивания происходят сложные химические и физические процессы, поэтому при выборе метода учитывают избирательное сродство структур клетки к определенным красителям с разными физико-химическими свойствами.

Различают красители основные (базальные), кислые и специальные. Структуры, окрашивающиеся основными красителями, называются базофильными, кислыми красителями — оксифильными, ацидофильными, эозинофильными.

Из основных (базальных) красителей используют гематоксилин, окрашивающий хроматин ядра и другие структуры, содержащие белок, в синий или фиолетовый цвет; кармин, окрашивающий ядро в светло-красный цвет, сафранин — темно-красная краска, тионин — синяя краска.

Из кислых красителей применяют эозин (окрашивает цитоплазму в розовый цвет), пикриновую кислоту (желтый цвет), фуксин (кирпичный цвет), индиго кармин (синий цвет).

При исследовании микроструктуры сырья и продуктов животноводства наиболее часто используется комбинированная окраска гематоксилином и эозином. Для этого срезы из воды на 1—3 мин переносят в раствор гематоксилина; 20—30 мин промывают в воде, на 3—5 мин помещают в раствор эозина и 3—5 мин промывают водой. Оставшуюся воду удаляют фильтровальной бумагой, наносят каплю 96%-ного этилового спирта на 1—2 мин, обезвоживают в 25%-ном растворе карболовой кислоты в ксилоле или толуоле. Затем на срез наносят 1—2 капли бальзама и закрывают покровным стеклом.

Из красителей, окрашивающих жировые включения часто используют судан 111. Для приготовления раствора красителя в 95 см3 85%-ного этилового спирта добавляют 5 см3 ацетона и насыпают порошок Судана III до получения насыщенного раствора (краситель должен содержаться в избытке). Смесь нагревают до 50% С и фильтруют. Срезы, полученные на замораживающем микротоме, помещают в 50%-ный этиловый спирт на 1—2 мин, а затем в судан III на 25 мин. Срезы ополаскивают в 50%-ном спирте, промывают дистиллированной водой и заключают в глицерин-желатин.

Капли нейтрального жира окрашиваются в оранжевый цвет за счет растворения Судана III в жирах. Выявить жировые включения можно также осмиевой кислотой, при этом жировые структуры окрашиваются в черный цвет.

Заключение под покровное стекло проводят в среды, не пропускающие воздух и способные долго сохранять срез. Окрашенные срезы обезвоживают в спиртах возрастающей крепости и заключают под покровное стекло в пихтовый, канадский бальзам или глицерин- желатин (препарат не должен соприкасаться со спиртами и ксилолом).

Подготовка препаратов для электронной микроскопии. Для исследования биологических объектов используют два вида электронных микроскопов: просвечивающий (трансмиссионный) и сканирующий (растровый).

Принцип обработки объекта для исследования в просвечивающем электронном микроскопе основан на тех же положениях, что и для оптических микроскопов: отбор проб, фиксация, промывание, обезвоживание, заливка, приготовление ультратонких срезов, контрастирование.

Отбор проб производится с учетом цели исследования и структуры материала, с соблюдением тех же правил, что и для световой микроскопии. Объем кусочков исследуемого материала не должен превышать 1 мм3. Главная цель фиксации — сохранить ткань по возможности близкой к прижизненному состоянию.

Фиксация проводится для лучшей сохранности структур, поэтому необходимо применять реактивы, имеющие определенные pH и изо- тоничность, величины которых определяются видом фиксируемой ткани. Процесс фиксации проводится в два этапа: префиксация и постфиксация. Для префиксации применяют раствор 2,5—3%-ного раствора глютарового альдегида (pH 7,2—7,4), продолжительность фиксации 2—4 ч. Постфиксацию осуществляют в 2%-ном растворе (pH 7,2—7,4) — 1—2 ч. Для сохранения прижизненной структуры рекомендуется использовать фиксатор низкой температуры (0—4 °С), и готовить фиксаторы на фосфатно-буферных, какодилатных, веро- нал-ацетатных растворах.

Промывка проводится 30%-ным холодным спиртом 5—7 раз, в каждой порции спирта выдерживают объект в течение 30 мин, т.е. отмывают от фиксатора до такого состояния, когда прекращаются окисляющее действие фиксатора.

Обезвоживание проводят этиловыми спиртами возрастающей крепости: 30, 50, 70, 96, 100% по 30 мин. При некоторых методах заливки для обезвоживания рекомендуется дополнительно использовать ацетон и пропиленоксид.

Заливка проводится в эпоксидные смолы (аралдит, эпон и др.). Полимеризацию смол в капсулах проводят в термостате при 60 °С до затвердения, как правило, в течение 1—2 суток.

Ультратонкие срезы получают с помощью стеклянных ножей на ультрамикротоме, для этого эпоксидные блоки затачивают в форме четырехгранной усеченной пирамиды. Серийные срезы сероватого цвета поступают в ванночку с 10%-ным этиловым спиртом. Полученные срезы монтируют на медные или палладиевые сеточки, на поверхность которых предварительно наносят пленку из формвара. Для выявления необходимых структур срезы на сеточках обрабатывают растворами цитрата свинца и уранилацетата.

Для сканирующей электронной микроскопии исследуемый образец фиксируют, обезвоживают в зависимости от цели исследования, используя вышеуказанные фиксаторы. После обезвоживания образец приклеивают на объект-держатель, помещают в напылительную установку и покрывают тончайшим слоем золота или платины. В отличие от просвечивающей электронной микроскопии для сканирующей можно использовать коррозийные препараты: объект изучения заливают какими-либо затвердевающими веществами и после этого просматривают слепки и поверхности. Изучают также реплики, получаемые путем замораживания — скалывания. В этом случае исследуют слепок скола поверхности объекта. Чтобы увеличить контрастность, реплики необходимо оттенить с помощью напыления частиц металлов (золота, платины) или угля.

Контрольные вопросы

  • 1. Какие методы используют при исследовании структур клеток, тканей и органов?
  • 2. Какие основные правила следует соблюдать при отборе проб для подготовки гистологических препаратов?
  • 3. Каковы особенности подготовки препаратов из костной ткани?
  • 4. В чем фиксируют исследуемый материал?
  • 5. Что используют для обезвоживания препаратов?
  • 6. Какие среды используют для заливки исследуемого материала?
  • 7. Какой краситель используют для выявления жировой ткани?
  • 8. Какой метод получения срезов чаще всего используют и почему?
  • 9. Назовите основные этапы подготовки препаратов для просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии.
 
<<   СОДЕРЖАНИЕ ПОСМОТРЕТЬ ОРИГИНАЛ   >>