Полная версия

Главная arrow Медицина arrow Геноидентификация вируса бычьего лейкоза

  • Увеличить шрифт
  • Уменьшить шрифт


<<   СОДЕРЖАНИЕ   >>

ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ И ЛАБОРАТОРНОДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И ЕГО ВОЗБУДИТЕЛЯ

Исследования проводились в 2011-2014 годы на кафедре биологической и неорганической химии ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана», ФГБУ «Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория» Россельхознадзора РФ (г. Казань), ГБУ «Республиканская ветеринарная лаборатория» РТ (г. Казань), в НПК «Синтол» (г. Москва), а также в сельхозпредприятиях районов Республики Татарстан Российской Федерации (РТ РФ).

При проведении эпизоотологических исследований анализировались статистические данные ветеринарной отчетности, результаты лабораторной диагностики на лейкоз крупного рогатого скота по РИД и гематологии.

Молекулярно-генетическому исследованию было подвергнуто 100 проб крови ВЬУ-позитивных коров сельхозпредприятий 16 районов РТ на предмет идентификации выявленных представителей вируса бычьего лейкоза (ВБЛ), как на основе филогенетического анализа секвенирован-ных последовательностей локуса елг-гена возбудителя, так и ПЦР-ПДРФ-генотипирования (табл. 1).

Экстракция тотальной ДНК из цельной крови крупного рогатого скота осуществлена с помощью коммерческого набора «ДНК-сорб Б» согласно инструкции производителя (ЦНИИ Эпидемиологии М3 РФ).

Таблица 1

Происследованные образцы провирусной ДНК ВБЛ_

п.п.

Район

Республики Татарстан

Происследоваио

образцов

і

Азнакаевский район

10

2

Алькесвский район

13

3

Буинский район

7

4

Высокогорский район

4

5

Дрожжановский район

1

6

Заинский район

8

7

Лаишсвский район

13

8

Лениногорский район

9

9

Муслюмовский район

1

10

Нижнекамский район

14

11

Пестречинский район

1

12

Сармановский район

2

13

Спасский район

1

14

Тукасвский район

9

15

Тюлячинский район

6

16

Чистопольский район

1

ВСЕГО ОБРАЗЦОВ

100

При постановке ПЦР с выделенными образцами провирусной ДНК BLV использовалась модификация «nested» ПЦР (табл. 2) с применением «внешних» («env5032» и «env5608») и «внутренних» («env5099» и «env5521») праймеров, инициирующих на заключительном этапе реакции амплификацию фрагмента епv-гена ВБЛ длиной 444 Ьр [89, 115, 137].

Эндонуклеазы рестрикции, подобранные для ПЦР-ПДРФ-генотипи-рования BLV в соответствии с филогенетической классификацией: Pvull, Sspl, Hph (изошизомер Л«/НР1), НаеIII, BstYl (изошизомер BstX 21).

Соответствующий ПДРФ-протокол генотипирования BLV, согласующийся с филогенетичекой классификацией, представлен в табл. 3.

ПЦР-ПДРФ-моделирование: NEBcutter v.2.0 ((http://tools.neb.com/ NEBcutter2/).

Детекция результатов ПЦР- и ПЦР-ПДРФ-анализа выполнена методом горизонтального электрофореза в 2,5% агарозном геле в буфере ТВЕ (pH 8,0), содержащем этидий бромид с последующей визуализацией результатов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (^=310 нм).

Размеры фрагментов ДНК оценены по подвижности в сравнении со стандартными ДНК маркерами.

В работе использованы реактивы для молекулярно-биологических исследований производства ООО «СибЭнзим» (Россия).

Таблица 2

Протокол «Nesedw-ПЦР (локус сиг-гена BLV)

1-й раунд ПЦР

Реактивы

Исходная

концентрация

Рабочая

концентрация

1

проба

(мкл)

10

проб

(мкл)

ёН,0

13,39

133,9

алта

2,5 мМ

0,25 мМ

2

20

Буфер для

Тар ДНК полимеразы

10х

2

20

Тар ДНК полимераза

5 ед

1 ед

0,2

2

Внешний праймер «епу5032»

65,9 мкМ

0,5 мкМ

0,15

1,5

Внешний праймер «спу5608»

39,0 мкМ

0,5 мкМ

0,26

2,6

Проба ДНК

2

ВСЕГО

20

Внешние праймеры:

«env5032»: 5/-TCTGTGCCAAGTCTCCCAGATA-3/ (22 н.)

«env5608»: 5-AAC А АС ААССТСТ GGG A AGGGT-3 (22 н.)

Режим ампли фи нации:

  • 1 х94°с - 4 мин, 40х94°С - 30 с, 62°С - 30 с, 72°С - 60 с
  • 1х72°С-5 мин

2-й раунд ПЦР

Реактивы

Исходная

концентрация

Рабочая

концентрац и я

1

проба

(мкл)

10

проб

(мкл)

ёН20

35,56

355,6

ёЖРв

2,5 мМ

0,25 мМ

5

50

Буфер для

Тар ДНК полимеразы

10х

1X

5

50

Тар ДНК полимераза

5 ед

2 ед

0,4

4

Внутренний праймер «епу5099»

44,5 мкМ

0,5 мкМ

0,56

5,6

Внутренний праймер «епу5521»

16,9 мкМ

0,5 мкМ

1,48

14,8

Проба ДНК

Нго раунда ПЦР

2

ВСЕГО

50

Внутренние праймеры:

епу5099: 5-СССАСААСООСОССССССОТТТ-3/ (22 н.) епу5521: 5/-ССОАСССССОСТССАОАОСТСО-3/ (22 н.)

Режим амплификац и и:

  • 1 х94°С - 4 мин, 40х94°С - 30 с, 68°С - 30 с, 72°С - 60 с
  • 1х72°С - 5 мин

ПДРФ-протокол генотипирования BLV

Таблица 3

1. PvuИ-ПДРФ

Реактивы

Исходная

концентрация

Рабочая

концентрация

1 проба (мкл)

10 проб (мкл)

dH20

5,8

58

BSA

10 мг/мл

0,1 мг/мл

0,2

2

SE-буфер G

10х

1 х

2

20

Pvull

10 ед

20 ед

2

20

ДНК 2-го раунда ПЦР

10

ВСЕГО

20

Инкубация при 37°С в течение ночи

2. Sspl-ТЩРФ

Реактивы

Исходная

концентрация

Рабочая

концентрация

1 проба (мкл)

10 проб (мкл)

dH20

6,8

68

BSA

10 мг/мл

0,1 мг/мл

0,2

2

SE-буфер К

10х

1 X

2

20

Sspl

10 ед

10 сд

1

10

ДНК 2-го раунда ПЦР

10

ВСЕГО

20

Инкубация при 37°С в течение ночи

З.ЛяиНРЬПДРФ

Реактивы

Исходная

концентрация

Рабочая

концентрация

1 проба (мкл)

10 проб (мкл)

dH20

1

70

SE-буфер О

Юх

1 X

2

20

AEvmHPI

4 ед

4 ед

1

10

ДНК 2-го раунда ПЦР

10

ВСЕГО

20

Инкубация при 37°С в течение ночи

4. НаеШ-ПДРФ

Реактивы

Исходная

концентрация

Рабочая

концентрация

1 проба (мкл)

10 проб (мкл)

dH20

6

60

SE-буфер G

Юх

1 X

2

20

Нае III

10 ед

20 ед

2

20

ДНК 2-го раунда ПЦР

10

ВСЕГО

20

Инкубация при 37°С в течение ночи

5. BstXll -ПДРФ

Реактивы

Исходная

концентрация

Рабочая

концентрация

1 проба (мкл)

10 проб (мкл)

dH20

1

70

SE-буфер G

Юх

1 X

2

20

BstXll

10 ед

10 ед

1

10

ДНК 2-го раунда ПЦР

10

ВСЕГО

20

Инкубация при 60°С в течение ночи

Секвенирование продуктов амплификации локуса env-гена выявленных изолятов провируса ВБЛ выполнено на генетическом анализаторе «ABI PRISM 3100» (Applied. Biosystems, США) в НПК «Синтол» (Россия) с использованием праймеров «env5099» и «env5521» в качестве си-квенсных.

Секвенированные последовательности локуса env-гена изолятов провируса BLV были выравнены по длине 400 нуклеотидов с соответствующими опубликованными в GenBank нуклеотидными последовательностями известных представителей BLV, используя программы BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) и MEGA-4 с последующим филогенетическим анализом.

Номера доступа (Accession Number, A/N) депонированных в GenBank NCBI в 2013 г. нуклеотидных последовательностей локуса елг-гена изолятов провируса BLV, выявленных у крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах Республики Татарстан: КС867136-КС867150, КС886607-КС886634 (табл. 4).

Таблица 4

Перечень изолятов ВЬУ и номеров доступа (СепВапк АЖ) их нуклеотидных последовательностей локуса епг-гена, депонированных нами в СепВапк 1ЧСВ1 в 2013 г.

I

II

III

IV

И юлят

GenBank

Изолят

GenBank

Изолят

GenBank

Изолят

GenBank

BLV

A/N

BLV

A/N

BLV

A/N

BLV

A/N

N001

КС867136

N021

KC867147

N054

KC886614

N090

KC886625

N002

КС867137

N022

KC867148

N062

KC886615

N092

KC886626

N003

КС867138

N023

KC867149

N063

KC886616

N094

KC886627

N005

КС867139

N025

KC867150

N066

KC886617

N097

KC886628

N006

КС867140

N027

KC886607

N067

KC886618

N099

KC886629

N007

КС867141

N029

KC886608

N069

KC886619

N100

KC886630

N013

КС867142

N030

KC886609

N074

KC886620

N121

KC886631

N015

КС867143

N031

KC886610

N078

KC886621

N122

KC886632

N017

КС867144

N034

KC886611

N082

KC886622

N123

KC886633

N018

КС867145

N035

KC886612

N084

KC886623

N142

KC886634

N019

КС867146

N050

KC886613

N089

KC886624

Сводный список проанализированных по елг-гену представителей ВБЛ, чьи нуклеотидные последовательности депонированы в базу данных СепВапк 14СВ1, представлен в табл. 5.1-5.5, где выделенные нами изоляты ВЬУ отмечены серым цветом.

CBOfliibiii ciihcok npoaiiajiH3HpoBaiuibix h30jihtob BLV no env-reny

I

II

III

IV

Miojixm

GenBank

Hio.iHm

GenBank

Miojiftm

GenBank

H30JiHtn

GenBank

n.n.

BLV

A/N

n.n.

BLV

A/N

n.n.

BLV

A/N

n.n.

BLV

A/N

001

AL-63

FJ808571

025

PBLV913

EF600696

049

UruLO 1IV

FM955543

073

UruC06IV

FM955560

002

AL-167

FJ808575

026

NB7

JQ686110

050

USPA

EF065656

074

UruC05V

FM955556

003

AL-112

FJ808572

027

Isfahan

EU266061

051

468-22

AY078387

075

UruC05III

FM955554

004

AL-220

FJ808576

028

Shahrekord

EU266060

052

Zanjan

EU266065

076

UruL03III

FM955551

005

JPEH-1

EF065652

029

Tehran

EU266063

053

USWI

EF065642

077

UruL03I

FM955550

006

JPAI-2

EF065651

030

Varamin

EU266064

054

Cow 527

AF007764

078

UruLO IX

FM955549

007

JPHY

EF065646

031

EU266066

055

K02120

079

UruLO 1IX

FM955548

008

CRAG-2

EF065640

032

30

AF399703

056

Cow 134

AF007763

080

UruLO 1VII

FM955546

009

CE08/176/MT

JN254640

033

CRAS-3

EF065637

057

JPMI-1

EF065660

081

UruLO 1III

FM955542

010

CE09/197/SP

JN254636

034

JPKA-2

EF065659

058

T029

AB099344

082

UruLO III

FM955541

Oil

AY995174

035

JPKA-1

EF065658

059

IW7

AB099338

083

UruLO IV

FM955544

012

485

AY 151262

036

JPAI-1

EF065657

060

JPMI-2

EF065661

084

UruC05IV

FM955555

013

141

AF547184

037

UruL07IX

FM955576

061

JPMI-3

EF065662

085

UruC05II

FM955553

014

PL-4315

FJ808589

038

UruL07VIII

FM955575

062

23

U87873

086

UruC06VI

FM955561

015

JPEH-2

EF065653

039

UruL07VI

FM955573

063

AL-2106

FJ808578

087

Uru8JD

FM955565

016

PL-3556

FJ808588

040

UruL07V

FM955572

064

Uru 13

FM209475

088

Uru 1R2

FM955564

017

PL-3252

FJ808585

041

UruL07II

FM955570

065

Uru7

FM209474

089

Uru 11JD

FM955568

018

PL-3222

FJ808584

042

UruL07I

FM955569

066

Uru 18

FM209473

090

UruC05I

FM955552

019

AL-148

FJ808573

043

UruC06III

FM955559

067

Uru24

FM209472

091

UruL09XXI

FM955583

020

PL-3254

FJ808586

044

UruC06I

FM955557

068

Uru34

FM209469

092

32

DQ059418

021

Australian

D00647

045

UruLO 1VIII

FM955547

069

UruL002I

FM955584

093

UruLO 1VI

FM955545

022

FLK-BLV

M35242

046

UruLOlI

FM955540

070

Uru9JD

FM955566

094

UruL09XI

FM955582

023

USIA

EF065644

047

UruL07VII

FM955574

071

UrulRl

FM955563

095

UruL09VI

FM955581

024

USID

EF065641

048

UruL07III

FM955571

072

Uru 1100

FM955562

096

UruL09I

FM955577

V

VI

VII

VIII

И золят

GenBank

M

Изолят

GenBank

M

Изолят

GenBank

M

Изолят

GenBank

п.п.

BLV

A/N

n.n.

BLV

A/N

n.n.

BLV

A/N

n.n.

BLV

A/N

097

UruL09II

FM 95 5 5 78

121

A2695

AB099318

145

USCA-1

EF065647

169

1

HM563773

098

UrulJD

FM955567

122

A2697

AB099319

146

USCA-2

EF065648

170

21

U87871

099

Uru38

FM209471

123

A22

AB099305

147

USCA-3

EF065649

171

K02251

100

Uru33

FM209470

124

LS-G2

FJ808592

148

JPFU

EF065650

172

AF033818

101

UruMC

FM209468

125

LS-Zoo2

FJ808598

149

BG

EF065638

173

PL1

AF067081

102

LSI

HE967301

126

PL9006

FJ808591

150

N10

HM102355

174

LB 5 9

M35238

103

LS2

HE967302

127

PL-1457

FJ808583

151

N72

JF683619

175

LS-SFB

FJ808596

104

LS3

HE967303

128

AL-6114

FJ808579

152

4-2

HM563781

176

LS-SFA

FJ808595

105

UruC06II

FM955558

129

A2757

AB099322

153

N097

KC886628

177

344

AF503581

106

VdM

M35239

130

A2613

AB099317

154

5Z

HM563780

178

LB285

M35240

107

Kurdistan

EU266062

131

A2608

AB099316

155

4Z

HM563779

179

BLVgp-11

AF111171

108

AL-164

FJ808574

132

A96

AB099306

156

5

HM563771

180

27

AY515277

109

LS-TSR2

FJ808597

133

A2060

AB099312

157

2

HM563772

181

145

AY515275

ПО

LS-LS1

FJ808594

134

A8086

AB099326

158

4

HM563770

182

58

AY515278

111

LS-GBA

FJ808593

135

A2699

AB099320

159

1C

JF720354

183

96

AY515273

112

PL-3371

FJ808587

136

A134

AB099308

160

8C

JF720356

184

8

AY515279

113

PL-1042

FJ808581

137

A9014

AB099327

161

9C

JF720357

185

7C

JF720355

114

B19

AF257515

138

A8028

AB099325

162

1S-C18

JQ353648

186

1S-C17

JQ353644

115

A2771

AB099324

139

Arg41

FJ914764

163

1S-C20

JQ353647

187

1S-C13

JQ353643

116

A2761

AB099323

140

384

AF399704

164

1S-C15

JQ353641

188

ls-cl2

JQ353637

117

A2715

AB099321

141

PL-247

FJ808580

165

NV13

JQ686111

189

NK4

JQ686118

118

A2368

AB099314

142

PL-4960

FJ808590

166

N025

KC867150

190

KA6

JQ686096

119

A2162

AB099313

143

ARGSF8

AF485773

167

N026

191

KE136

JQ686095

120

A179

AB099309

144

AL-1453

FJ808577

168

N096

192

1 8 RU

HQ902262

IX

X

XI

XII

И золят

GenBank

Изолят

GenBank

Изолят

GenBank

Изолят

GenBank

п.п.

BLV

A/N

п.п.

BLV

A/N

п.п.

BLV

A/N

п.п.

BLV

A/N

193

1S-c14

JQ353642

217

R6077

JQ686107

241

N056

265

1S-C16

JQ353652

194

NB3

JQ686108

218

R9884

JQ686105

242

N054

КС886614

266

N015

KC867143

195

КЕ7

JQ686093

219

R6164

JQ686104

243

N074

КС886620

267

N016

196

1 4 RU

HQ902260

220

NV3

JQ686112

244

N075

268

N062

KC886615

197

MS9368

JQ686100

221

R6136

JQ686103

245

N078

КС886621

269

N127

198

MS3630

JQ686099

222

R5070

JQ686102

246

N079

270

N128

199

MS3569

JQ686098

223

R5164

JQ686106

247

N080

271

N129

200

N069

КС886619

224

R5036

JQ686101

248

N082

КС886622

272

N130

201

N072

225

NV14

JQ686113

249

N084

КС886623

273

N131

202

4Т-с5

JQ353668

226

4Т-с2

JQ353666

250

N086

274

N132

203

4Т-с6

JQ353659

227

1S-C19

JQ353639

251

N087

275

N134

204

4Т-с4

JQ353669

228

N001

КС867136

252

N090

КС886625

276

N136

205

4Т-сЗ

JQ353660

229

N002

КС867137

253

N110

277

N137

206

4Т-с7

JQ353657

230

N004

254

N111

278

N138

207

MS3566

JQ686097

231

N007

КС867141

255

N113

279

N139

208

ЗК

НМ563782

232

N018

КС867145

256

N114

280

N140

209

НМ563783

233

N019

КС867146

257

N124

281

N023

KC867149

210

МКС5233

JQ675758

234

N022

КС867148

258

N092

КС886626

282

1 BY

HQ902258

211

КЕ107

JQ686094

235

N027

КС886607

259

N095

283

2 BY

HQ902259

212

МС57

JQ686092

236

N033

260

N094

КС886627

284

N029

KC886608

213

МС45

JQ686091

237

N031

КС886610

261

N100

КС886630

285

N083

214

МС46

JQ686090

238

N028

262

N122

КС886632

286

N085

215

МС19

JQ686089

239

N050

КС886613

263

N123

КС886633

287

N091

216

1 S-c 11

JQ353646

240

N053

264

3

U87872

288

N030

KC886609

XIII

Х1У

ХУ

ХУ1

Изолят

СепВапк

М

Изолят

СепВапк

Изолят

СепВапк

Изолят

СепВапк

п.п.

ВЬУ

АЛУ

п.п.

ВЬУ

ААV

п.п.

ВЬУ

АЛУ

п.п.

ВЬУ

АЛУ

289

N034

КС886611

313

СЕ07/04/8Р

^254637

337

28

^720350

361

I 7 Яи

НО902261

290

1Э-С9

10353640

314

СЕ09/159/8Р

^254638

338

4Т-с16

.10353665

362

4Т-с14

.10353671

291

ЫК11

10686117

315

34

00059419

339

18-с5

10353635

363

4Т-с17

10353664

292

70

НМ563778

316

151

АУ185360

340

NV12

10686115

364

4Т-с 18

10353667

293

107

НМ563755

317

135

АУ283061

341

NV20

.10686116

365

18-с8

.10353636

294

67

НМ563775

318

89

АУ277947

342

N035

КС886612

366

МКС3877

.10675756

295

65

НМ563776

319

50

ОО059421

343

N064

367

N103

.10686119

296

N1312

10686109

320

2

00059420

344

N081

368

18-с2

10353638

297

18-с 10

10353650

321

25

00059415

345

N108

369

4Т-с15

10353653

298

СЯА8-1

ЕЕ065635

322

10

00985389

346

N116

370

4Т-с13

10353654

299

СЯА8-2

ЕЕ065636

323

СЕ08/180/8Р

Ж254639

347

N118

371

МКС626

10675757

300

СЯЕС-2

ЕЕ065654

324

N28

НМ102356

348

N120

372

N003

КС867138

301

8513

АЕ399702

325

N013

КС867142

349

N125

373

N008

302

31

?0059416

326

N014

350

N133

374

N005

КС867139

303

13

00985390

327

N057

351

НМ563757

375

N017

КС867144

304

СЕ09/87/8Р

JN254634

328

N058

352

ЗТ

НМ563756

376

N021

КС867147

305

СЯЬУ

ЕЕ065643

329

N060

353

2

НМ 563 750

377

N066

КС886617

306

оюс

ЕЕ065639

330

N061

354

5

НМ563749

378

N099

КС886629

307

CR.EC-1

ЕЕ065655

331

176

АУ515276

355

3

НМ563748

379

N101

308

СЯАО-1

ЕЕ065645

332

1

АУ515280

356

3-1

НМ563761

380

N102

309

РЬ-1238

Е.1808582

333

НМ563754

357

3-3

НМ563760

381

N104

310

29

00985391

334

НМ563753

358

3-18

НМ563759

382

N105

311

СЕ09/80/8Р

JN254633

335

4

НМ563752

359

3-15

НМ563758

383

N106

312

СЕ09/196/МТ

JN254635

336

3

НМ563751

360

160

НМ563763

384

12

883530

CBOflHbiH cnncoK npoHHa.iii3ifpoBBHHbix h30jihtob BLV no env-reHy

XVII

XVIII

XIX

XX

Hio.inm

Gen Bank

Hiosinm

Gen Bank

M

Hiojinm

Gen Bank

M

Hiojinm

GenBank

n.n.

BLV

A/N

It. ft.

BLV

A/N

n.n.

BLV

A/N

n.n.

BLV

A/N

385

14

AY515274

409

N063

KC886616

386

30

DQ059417

410

N068

387

3S

JF720351

411

2-48

HM563768

388

5S

JF720353

412

N006

KC867140

389

1S-c3

JQ353645

413

N009

390

4T-cl9

JQ353655

414

N089

KC886624

391

4T-c20

JQ353661

415

N174

JF713455

392

4T-c21

JQ353663

416

MKC3511

JQ675760

393

1S-c4

JQ353651

417

N121

KC886631

394

NK17

JQ686120

418

N142

KC886634

395

4T-cl2

JQ353662

419

ELG Cro/VRA/09

JN990072

396

4S

JF720352

420

ELG Cro/BIO/10

JN990074

397

1S-c6

JQ353633

421

4-6

HM563764

398

4T-c 11

JQ353656

422

MKC2137

JQ675759

399

N067

KC886618

400

lS-cl

JQ353649

401

4T-cl

JQ353658

402

Ml/ELG Cro/08

GU724606

403

ELG Cro/BEM/08

JN990069

404

ELG Cro/OSA/08

JN990070

405

ELG Cro/MIT/09

JN990073

406

ELG Cro/ORA/09

JN990071

407

3-43

HM 5 63 767

408

4-1

HM563766

 
<<   СОДЕРЖАНИЕ   >>