Полная версия

Главная arrow Агропромышленность arrow Биотехника воспроизводства с основами акушерства

  • Увеличить шрифт
  • Уменьшить шрифт


<<   СОДЕРЖАНИЕ   >>

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ

При применении традиционных методов разведения и селекции животных высокий генетический потенциал невозможно использовать полностью, нужна принципиально новая система селекционноплеменной работы, которая обеспечила бы резкое ускорение процесса генетического совершенствования популяции животных. Она должна базироваться на биотехнологических методах управления воспроизводством. Ускоренное управляемое воспроизводство животных позволяет максимально использовать резервные репродуктивные и продуктивные потенции, которые не реализуются при естественном осеменении.

С внедрением в практику животноводства биотехнического приема — метода искусственного осеменения — селекционеры приобрели возможность направленно регулировать участие ценных про-зводителей в процессе воспроизводства, интенсивно их использовать для быстрого качественного улучшения стада в широких масштабах. Однако участие самок в процессе воспроизводства остается незначительным. Так, за продуктивную жизнь коровы, какой бы высокопродуктивной она ни была, от нее можно получить обычным путем не более 10 телят. Этот показатель увеличивают путем трансплантации (пересадки) эмбрионов, который позволяет использовать в полной мере энергетический, продуктивный и наследственный потенциал коров-рекордсменок.

Сущность этого метода состоит в последовательном применении клинических, биотехнических и лабораторных приемов, позволяющих вызвать суперовуляцию (искусственное увеличение числа овуляций у ценных самок-доноров с последующим их осеменением спермой самцов-улучшателей, извлечением (вымыванием) эмбрионов на ранних стадиях развития и их переносом (пересадкой) в половые пути ценных самок-реципиентов для получения приплода-трансплантанта, сочетающего в себе высокие племенные и продуктивные качества самца-производителя и самки-донора). Пересадка эмбрионов не заменяет, а лишь дополняет метод искусственного осеменения.

Первую трансплантацию эмбрионов провел в 1890 г. английский ученый У. Хип, который пересадил несколько зигот, извлеченных из организма крольчих, самкам другой породы, и получил полноценное потомство. В последующем были проведены эксперименты по трансплантации зигот (эмбрионов) крольчих русским врачом М. Она-новым (1891), казанским гинекологом В.С. Груздевым (1897), Пин-кусом (1936) В 1931 г. Варвик и Берри осуществили пересадку эмбрионов у овец и коз. В 1980-е гг. широкую известность получили сенсационные опыты итальянского врача Петруччи, которому удалось достичь оплодотворения вне организма женского яйца и проследить развитие до двухмесячного возраста человеческого зародыша, помещенного в искусственную колыбель.

Опыты по трансплантации эмбрионов были продолжены в нашей стране. Одним из первых эксперимент по трансплантации зигот у овец провел советский биолог А.И. Лопырин (1949—1952). В 1950-е гг. А. В. Квасницкий успешно провел опыты по пересадке зигот у свиней. Приходится сожалеть о том, что проведенные этими учеными исследования, опередившие зарубежный научный уровень тех лет, в дальнейшем были приостановлены как неперспективные.

Первые опыты по пересадке зигот у овец с применением метода суперовуляции провели в 1955 г. английские ученые Г.Л. Едварде и Л.Е. Роусон. В 1961 г. Роусон осуществил переброску овечьих зигот самолетом на расстояние 6 тыс. миль, использовав «живые инкубаторы» — яйпепроводы крольчих.

В 1931 г. Хартман впервые извлек жизнеспособные эмбрионы из яйцепроводов убитой коровы, в 1951 г. Е.Л. Виллет и др. получили первого, а в 1953 г. — двух телят после пяти пересадок зигот на стадии 8—12 бластомеров. Последующие усилия этих исследователей были направлены на разработку способов множественной овуляции (полиовуляции), повышение выхода полноценных зародышей, разработку методов культивирования эмбрионов вне организма, оплодотворение овоцитов.

Накопленный к началу 1970-х гг. опыт показал, что трансплантацию эмбрионов можно переносить из лаборатории в практику животноводства. Уместно отметить, что метод трансплантации эмбрионов приобрел практический смысл после того, как его соединили с техникой вызывания множественной овуляции. 1970-е гг. ознаменовались началом практического применения этого метода в ряде стран (Великобритании, США, Канаде, ФРГ, Австрии, Новой Зеландии, ЧССР, Венгрии), в которых появились фирмы, занимающиеся получением телят-трансплантантов от высокопродуктивных коров.

Значительный прогресс в технологии трансплантации эмбрионов (зигот) достигнут во Франции, где этот метод впервые применили в 1983 г. Было сделано 3,3 тыс. эмбрионопересадок, причем большинство из них — в условиях животноводческой фермы, одновременно было запасено в замороженном состоянии свыше 1 тыс. эмбрионов.

Максимальный практический размах трансплантация эмбрионов получила в США и Канаде, где количество эмбрионопересадок превышало 100 тыс. в год. Уже в 1988 г. в центрах искусственного осеменения крупного рогатого скота этих стран имелось более 1 тыс. быков-трансплантантов.

Фермеры капиталистических стран по достоинству оценили метод трансплантации эмбрионов и несмотря на высокую стоимость эмбрионопересадок (до 2 тыс. долл. США) охотно включают их в свои селекционные программы. Имеется сообщение о том, что на одном из аукционов США бычок-трансплантант голштино-фриз-ской породы был оценен в 130 тыс. долл. США.

В республиках бывшего СССР первого теленка-трансплантанта получили в 1975 г., однако началом внедрения метода трансплантации эмбрионов в практику животноводства следует считать 1984 г., когда было получено свыше 2 тыс. телят-трансплантантов.

Трансплантация эмбрионов является принципиально новым биотехническим методом направленного управления воспроизводством стада, эффективным средством интенсификации прогресса в животноводстве. Метод пересадки позволяет полнее использовать потенциальную плодовитость самок, чтобы получить от тех из них, которые отличаются высокой (рекордной) продуктивностью, максимальное число потомков и за счет этого комплектовать маточное стадо и поголовье производителей только выдающимися животными. Это значительно ускоряет селекцию животных по желаемым признакам, создает предпосылки к созданию однородного стада, сформированного из высокопродуктивных животных, происходящих от одной пары родителей-рекордистов. При этом можно значительно увеличить количество коров, необходимых для производства стада.

Обычно от одной коровы-донора за одну обработку получают до пяти телят. Если же корову-донора использовать 2—5 раз в течение года, то от нее за этот срок можно получить от 6—10 до 20—25 телят. Имея всего 20 коров-рекордисток, видимо, можно в течение года

создать ремонтное стадо численностью 200 голов, тогда как в обычных условиях от этих же коров за это же время получают не более 10 телят. Следовательно, трансплантация эмбрионов — это перспективный метод быстрого размножения высокопродуктивных животных, особенно редких пород, генетически уникальных индивидуумов.

Трансплантация эмбрионов способствует получению от ценной матери значительного количества сыновей, которые уже к началу интенсивного полового использования могут быть оценены по продуктивности своих полных сестер (сибсов). В связи с этим во многих странах основной целью трансплантации эмбрионов является получение быков от выдающихся коров для использования их в сети искусственного осеменения животных.

Таким образом, трансплантация эмбрионов в значительной мере повышает эффективность отбора самцов-улучшателей для комплектования предприятий по искусственному осеменению.

В перспективе метод трансплантации эмбрионов может стать средством сохранения и воспроизводства генофонда редких и исчезающих пород животных. Его применение упрощает обмен генофондом между странами: отпадают транспортные проблемы, необходимость осуществления карантинных мероприятий, облегчается акклиматизация пород и гибридов, поэтому расширяются возможности использования мировых генетических ресурсов. В ряде стран родившихся в результате трансплантации животных заносят в племенные книги. Вот почему замороженные эмбрионы сельскохозяйственных животных становятся предметом экспорта и импорта.

В мясном скотоводстве метод трансплантации может быть использован для повышения плодовитости путем получения двоен: за счет пересадки одному реципиенту двух эмбрионов (в оба рога) или дополнительной пересадки (подсадки) эмбриона в свободный рог уже оплодотворившегося животного.

Следует учитывать, что трансплантация эмбрионов может служить основой изучения различных аспектов репродуктивной функции животных, влияния на многих из них эндо- и экзогенных факторов. Результат исследований (физиолого-биохимических, генетических, гистологических, иммунологических, микробиологических, гинекологических и др.) послужит фундаментом для далыдей-шего совершенствования метода.

Высказывается такое мнение: используя в качестве доноров животных, устойчивых к таким заболеваниям, как лейкоз, мастит и т.п., можно передать потомству определенную иммунологическую резистентность к этим заболеваниям. В связи с этим весьма заманчива идея искоренения лейкоза в молочном скотоводстве с помощью пересадки зародышей. Западногерманские специалисты полагают, что с помощью метода трансплантации эмбрионов можно получить здоровое потомство даже от инфицированных доноров.

С учетом изложенного очевидно, что трансплантация эмбринов — перспективный метод интенсификации воспроизводства стада высокопродуктивных животных, предусматривающий максимальное использование генетического потенциала выдающихся животных-рекордистов. Однако необходимо принять во внимание следующее.

Во-первых, трансплантация эмбрионов эффективна лишь при использовании в качестве доноров и производителей генетически ценных животных, проверенных по качеству потомства, и признанных улучшателей.

Во-вторых, успех трансплантации зависит в значительной мере от качества и состояния здоровья (в том числе состояния половых органов) доноров и реципиентов; действенности метода, средств, схем гормональной обработки животных, способствующих появлению у них суперовуляции; уровня реактивности (чувствительности) доноров на их гормональную обработку и степени стимулированной суперовуляции; качества спермы производителей, используемой для осеменения доноров и оплодотворяемости овулировавших яйцеклеток; полноты вымывания эмбрионов, эффективности применяемых методов культивирования и хранения эмбрионов вне организма; совершенства методики пересадки эмбрионов реципиентам; синхронности половой функции у доноров и реципиентов; прижив-ляемости эмбрионов и способности реципиента к плодоношению.

В-третьих, положительные стороны применения трансплантации эмбрионов в животноводстве могут проявиться в полной мере только при полноценном кормлении, правильном содержании, рациональном использовании доноров и реципиентов, интенсивном направленном выращивании ремонтного молодняка, проведении в хозяйстве плановой целенаправленной селекционно-племенной работы с оценкой животных по комплексу хозяйственно-полезных признаков, систематическом осуществлении плановых мероприятий по профилактике и ликвидации бесплодия маточного поголовья на основе результатов регулярной акушерско-гинекологической диспансеризации животных, наличии высококвалифицированных специалистов, владеющих в совершенстве теорией и практикой пересадки зародышей, обеспечении при применении метода благоустроенным помещением, соответствующим оборудованием, реактивами и препаратами.

Гарантом эффективности метода трансплантации эмбрионов является разумный подход к его применению на строго научной основе, неукоснительное соблюдение технологических требований.

Заложенные в эмбриональный период развития животных половые органы у самок проявляют свою функциональную активность с наступлением половой зрелости. С наступлением у самок половой зрелости (у телок — в 6—12, у кобыл — в 18, у свинок — в 5—8, у ярок — в 5—8 мес) в их яичниках происходит созревание фолликулов, изменяется эндокринный фон, что сопровождается соответствующими морфофункциональными изменениями в гениталиях, которые направлены на создание благоприятных условий для осеменения, оплодотворения и беременности, а также изменениями в поведении и половой активности животных. Указанные изменения, повторяющиеся в определенной последовательности от одной овуляции до другой в течение репродуктивной жизни самки (чередование выраженной половой активности и относительного покоя), названы половым циклом.

Согласно учению А.П. Студенпова половой цикл включает три стадии: возбуждение, торможение и уравновешивание. Стадия возбуждения характеризуется четырьмя взаимосвязанными фазами (феноменами):

  • 1) течкой (oestrus) — морфофункциональными изменениями в половых органах (проявляются гиперемией, набуханием вульвы, слизистой оболочки влагалища и его преддверия, видимой части шейки матки, раскрытием цервикального канала, течением из гениталий наружу слизи);
  • 2) общей реакцией организма — возбуждением (reactio) — изменением в поведении самки, проявляющимся беспокойством, вспрыгиванием на других самок, снижением аппетита и продуктивности;
  • 3) половой охотой (libido sexualis) — положительной сексуальной реакцией самки на самца, проявляющейся как «рефлекс неподвижности»;
  • 4) овуляцией (ovulatio) — завершением созревания фолликула, его разрывом с выходом из него в яйцепровод зрелой яйцеклетки.

Указанные феномены проявляются в определенной последовательности, наслаиваясь один на другой. С учетом особенностей формирования и времени проявления указанных фаз стадии возбуждения различают половые циклы синхронные (при совпадении времени проявления всех феноменов) и асинхронные (если время начала и окончания проявления отдельных фаз стадии возбуждения не совпадает). В зависимости от физиологического состояния самки, условий ее кормления, содержания и эксплуатации, половые циклы могут быть полноценными (все фазы стадии возбуждения хорошо выражены, проявляются своевременно) или неполноценными (при выпадении того или иного феномена) — анэстральными, ареактив-ными, алибидными или ановуляторными.

Стадии торможения характеризуются учащением признаков полового возбуждения. Для стадии уравновешивания характерно динамическое равновесие между процессами возбуждения и торможения, проявляющееся в относительном половом покое.

О видовых особенностях половых циклов можно судить по следующим данным. У коров после отела стадия возбуждения проявляется через 18—25 сут и продолжается 2—5 сут. Формирование стадии возбуждения:

  • • сначала появляются признаки течки;
  • • затем (через 2—4 сут) полового возбуждения;
  • • через 4— 15 ч проявляется феномен охоты, которая продолжается

от 10— 13 до 17—23 ч (в среднем 16 ч);

• через 10— 15 ч после окончания охоты происходит овуляция.

Продолжительность половых циклов — 18—22 сут (в среднем

21 сут).

У овец при благоприятных условиях кормления и содержания стадия возбуждения может проявиться в течение 1 мес после родов, но чаще она проявляется в определенном сезоне (августе-марте). Стадия возбуждения длится 3—6 сут. На фоне течки и общей реакции синхронно проявляется охота, которая продолжается в зависимости от породной принадлежности овец: от 38—40 ч — у овец асканий-ской, тонкорунной, каракульской, коридельской, гемширской, шубных пород, а также у мериносовых овец Северного Кавказа; до 41—70 ч — у овец романовской породы (в среднем у ярок — 46 ч, у взрослых животных — 59 ч). Овуляция происходит в основном через 27—31 ч (у романовских овец — через 36 ч) и завершается через 30—36 ч (у романовских овец растягивается до 52 ч) после начала охоты. У большинства животных фолликулы овулируют между 44-м и 49-м ч. Продолжительность полового цикла — 14—19, чаще 14— 17 сут.

У кобыл стадия возбуждения возникает после родов на 5-е, чаще 7—12-е сут и длится 6—12 сут. На фоне течки и общей реакции проявляется охота, продолжающаяся 2—12 сут (у молодых кобыл — до 4—5, у кобыл среднего возраста — 5—7, у старых кобыл — 7—12 сут). Овуляция часто совпадает со временем наиболее яркого проявления течки, полового возбуждения и охоты, происходит в конце последней, продолжительность полового цикла — в среднем 20—21 сут.

У свиньи при благоприятных условиях существования стадии возбуждения могут проявляться в течение 1 мес после родов, чаще же после отъема поросят. Стадия возбуждения формируется синхронно (течка, половое возбуждение и охота проявляются друг за другом в течение 24 ч) и асинхронно (между проявлением отдельных феноменов проходит 24—77 ч). Течка и общая реакция чаще длится 3— 4 сут. Охота у большинства свиноматок начинается через 1 сут после стадии возбуждения и длится у ремонтных свинок — в среднем 40 ч, у основных маток — 50—54 ч. Овуляция чаще происходит на 2-е сут проявления охоты (в среднем через 24 ч после ее начала) и продолжается от 1—3 до 24—48 ч (чаще 10—12 ч).

Воспроизводительный процесс у животных начинается с осеменения, т.е. введения спермы самца в половые пути самки. Естественное осеменение животных — половой акт (коитус) становится возможным благодаря проявлению у самок и самцов врожденных половых рефлексов: обнимательного, совокупительного, эрекции, эякуляции. В настоящее время воспроизводство животных базируется на массовом применении метода искусственного осеменения.

При выборе оптимального времени осеменения учитывают сроки жизнеспособности и сохранения оплодотворяющей способности спермиев в половом аппарате самок (до 24—48 ч) и яйцеклеток после овуляции (4—6 ч), время, необходимое для дозревания в яйцепроводе спермиев (не менее 6 ч) и яйцеклеток (до 2 ч), а также видовые особенности полового цикла. Осеменение следует проводить во время фазы половой охоты, выявляемой с помощью самца-пробника, до наступления овуляции. Чтобы осеменение было результативным, необходимо обеспечить наличие в дозе, вводимой в половые пути самок, оптимального количества активных, способных к оплодотворению яйцеклетки спермиев; у разных видов животных оно различно. При выборе способа искусственного осеменения животных разных видов принимают во внимание тип их естественного осеменения. К животным с влагалищным типом естественного осеменения (коров, телок, овец) применяют цервикальный способ иску-ственного осеменения; искуственное осеменение животных с маточным типом осеменения осуществляют маточным способом, используя соответствующие инструменты.

Осеменение в сочетании с рядом способствующих факторов обеспечивает встречу спермиев с яйцеклеткой в верхней трети яйцепро-вода и оплодотворение, т.е. физиологический процесс, заключающийся в слиянии яйца и спермиев с последующей их взаимной ассимиляцией и диссимиляцией, в результате чего образуется качественно новая клетка — зигота с полным (диплоидным) набором хромосом, обладающая двойной наследственностью (отцовской и материнской). Оплодотворение у животных состоит из нескольких стадий: денудации (освобождения яйцеклетки от лучистого венца — фолликулярных клеток под воздействием гиалуранидазы спермиев), проникновения спермиев через прозрачную оболочку и околожел-точное пространство, введения спермия в цитоплазму яйцеклетки через желточную оболочку и образования двух пронуклеусов с половинным (гаплоидным) набором хромосом в каждом из них, слияния пронуклеусов.

Образовавшаяся зигота получает могучий стимул для дальнейшего развития и начинает быстро дробиться с увеличением числа бластомеров. Ядро зиготы делится с интервалом примерно 24 ч на два, четыре, восемь и т.д. бластомеров. Дробление зиготы коровы длится около 8 сут. В течение первых 2—4-х сут дробление происходит в яйцепроводе, а затем в одном из рогов матки. Примерно на 4—5-е сутки дробящиеся бластомеры образуют плотную группу клеток (16—32) — раннюю морулу, наружный слой которой (трофо-бласт) состоит из быстроделящихся мелких светлых бластомеров, а внутренний слой (эмбриобласт) — из медленно делящихся бластомеров. На 5—7-е сут формируется поздняя морула, состоящая из 32—90 бластомеров, а на 7—8-е сут между трофобластом и эмбрио-бластом образуется полость, заполненная жидкостью — это ранняя бластоциста с 80—120 бластомерами. На 19-е сут бластоциста преобразуется в эмбрион с внезародышными оболочками. Имплантация зародыша к слизистой оболочке матки происходит спустя 18—20 сут у овец, 18—21 сут у крупного рогатого скота, 11 сут у свиней.

С момента оплдотворения начинается зародышевый период, продолжающийся: у коровы — 60 сут, у овцы — до 48 сут, у свиньи — 38 сут. В это время идут закладка органов, формирование плодных оболочек. Последующие дни до родов — плодный период; в это время происходит рост органов, завершается формирование тела.

Внутриутробное развитие нового организма определяет особое физиологическое состояние самки, связанное с плодоношением, именуемое беременностью, которая начинается с момента оплодотворения — дня последнего (плодотворного) осеменения и заканчивается рождением зрелого плода, характеризуется комплексом изменений обмена веществ, гематологического и гормонального статуса, морфофункциональных изменений всех физиологических систем организма самки, которые обеспечивают нормальное развитие эмбриона и плода. Следовательно, нормальное течение беременности обеспечивается диалектическим единством, взаимосвязью противоположностей: материнского организма и внутриутробного развивающегося индивидуума. Нарушение этого единства ведет к аборту — преждевременному прерыванию беременности. Оптимальный режим кормления, содержания и эксплуатации беременных самок, для которых присуща напряженность всех функций, призван способствовать рождению здорового приплода, предупреждению перехода физиологической беременности в патологическую.

Направленное регулирование воспроизводства животных должно базироваться на знании особенностей нейрогуморальной регуляции сексуальных процессов.

Ритмичность половых циклов, последовательность и взаимосвязь их стадий и фаз (феноменов) объясняются взаимодействием нервной и гуморальной (эндокринной) систем организма. Необходимым условием возникновения и проявления половых циклов является наличие двух групп гормонов:

  • 1) гонадотропных — фолликулостимулирующего (ФСГ), лютеи-низирующего (ЛГ) и лютеотропного (ЛТГ), или лактогенного, вырабатываемых гипофизом, а во время беременности — также плацентой;
  • 2) гонодальных, или овариальных, вырабатываемых в яичниках, — фолликулярного (фолликулин), или эстрогенного (известны три вида эстрогенов: эстрон, эстрадиол, эстриол, из которых наиболее активным является второй), образующегося в созревающих фолликулах, и прогестрона — гормона желтого тела. В регуляции половых процессов участвуют гормоны других эндокринных желез (надпочечников, щитовидной железы, тимуса). Вся гуморальная система получает первичные импульсы от коры головного мозга.

На формирование и проявление нового цикла, кроме внутренних, влияют и внешние факторы: первостепенное значение имеют корм, свет, самец. С кормом в организм животных поступают стероны и витамины, из которых под влиянием инсоляции синтезируются фолликулоподобные вещества; они создают благоприятный фон для воздействия самца на самку.

Раздражение факторами внешней среды воспринимается рецепторами глаз, кожи, пищеварительного тракта и других органов, а также обонятельными, зрительными, слуховыми, осязательными (тактильными) анализаторами, по центростремительным нервам поступает в кору головного мозга, откуда центробежными путями передается к гипоталамусу. Здесь образуется нейросекрет (релизинг-фактор), который через кровь воздействует на гипофиз.

Задняя доля гипофиза продуцирует питуитрин (основной его составной частью является окситоцин), который усиливает сократительную активность гладких мышц полового тракта и вымени. Нейросекрет гипоталамуса также пробуждает гипофиз (его переднюю долю) к выделению ФСГ, поступление которого в кровь обсуловли-вает развитие и созревание в яичниках фолликулов. Созревание одного или нескольких фолликулов сопровождается образованием эстрогенов, которые через хеморецепторы и анализаторы головного мозга вызывают течку, общее возбуждение и охоту. Наличие большого количества эстрогенов затормаживает секрецию ФСГ и одновременно стимулирует выделение передней долей гипофиза ЛГ и ЛТГ. Под влиянием Л Г (при оптимальном соотношении ФСГ и ЛГ примерно 1:10) происходят овуляция и формирование желтого тела. Литеотропный гормон регулирует функцию желтого тела, пробуждает его к выработке прогестерона, стимулирует функцию молочной железы во время лактации. Гормон желтого тела тормозит дальнейшее выделение ЛГ, стимулирует лютеотропную функцию гипофиза, не препятствует секреции ФСГ, в результате чего происходит рост новых фолликулов, и половой цикл повторяется.

При наступлении беременности пролиферативные процессы в матке, возникшие во время течки, под действием гормона желтого тела усиливаются. Прогестерон обусловливает развитие секреторной функции эндометрия, подготавливает слизистую оболочку матки к прикреплению зародыша и его нормальному развитию, способствует сохранению беременности в начальной стадии (при его недостатке или выдавливании желтого тела происходит гибель зародыша, наступает аборт); он тормозит рост фолликулов и овуляцию, препятствует сокращению матки (антифолликулярная функция прогестерона), вызывает гипертрофию молочных желез и подготавливает их к лактационной деятельности.

В регуляции половой функции принимают участие продуцируемые слизитой оболочкой матки и другими органами простаглан-дины, которые стимулируют синтез пролактина, прогестерона и других гормонов, снижают секрецию лютеотропина, участвуют в регуляции родового акта; ПГ-Ф увеличивает сократимость матки, стимулирует рассасывание желтого тела, уменьшая содержание прогестерона в крови; ПГ-Е уменьшает сократимость матки.

Донор (от лат. (1опо — дарю) — самка, достигшая анатомо-физиологической зрелости, с высокой племенной ценностью, от которой после гормональной стимуляции, суперовуляции и осеменения спермой выдающегося производителя получают эмбрионы. Реципиент (от лат. геарю — тот, который получает, принимает) — это менее продуктивное животное, которое используется для вынашивания эмбрионов. Телята, полученные от них, именуются трансплантатами.

Отбор высокопродуктивных животных является основным селекционным приемом, позволяющим повышать их продуктивность из поколения в поколение. При трансплантации эмбрионов требуется максимально использовать имеющихся в племенных стадах самок-рекордисток в качестве доноров эмбрионов, которые будут вынашиваться менее продуктивными животными-реципиентами. Основным критерием отбора коров-доноров служит уровень молочной продуктивности, т.е. их высокая генетическая оценка и способность передавать желательные признаки потомкам. При отборе доноров учитывают их происхождение, продуктивность родителей, продолжительность хозяйственного использования, наличие в родословной выдающихся предков, их воспроизводительные качества.

Продуктивность доноров за несколько лактаций должна быть на 50—80% выше стандарта по породе, а содержание жира в молоке — равным или выше стандарта. По мнению французских специалистов, разница в продуктивности донора и реципиента должна составлять не менее 200 кг молока. Согласно принятым в СССР нормативам для использования в качестве доноров пригодны коровы с уровнем молочной продуктивности не менее 7000 кг молока за 305 сут лактации при содержании 3,6—4,2% жира. Отбор матерей-доноров будущих быков проводят еще тщательнее. Помимо оценки по уровню молочной продуктивности и жирномолочности, при отборе коров-до-норов используют ряд дополнительных признаков: форму вымени и сосков, скорость молокоотдачи, содержание белка в молоке, особенности конституции, крепость костяка и копыт, наследственную устойчивость (предрасположенность к маститу и другим заболеваниям), показатели воспроизводительной функции за несколько отелов, адаптационные свойства. По комплексу селекционных признаков (уровню молочной продуктивности, форме вымени и сосков, скорости молокоотдачи, конституции) коровы-доноры должны отвечать требованиям класса элита-рекорд, быть устойчивыми к болезням, стойкими к технологическим стрессам, иметь высокую воспроизводительную способность. Обычно в качестве доноров используют молодых (4—5-летних) только здоровых высокопродуктивных коров или коров заводской упитанности, без нарушений обмена веществ, имевших за последние три года не менее двух нормальных отелов с оптимальной продолжительностью послеродового и межотельного периода. Малопригодны для этих целей животные в возрасте 8 лет и старше в связи с понижением суперовуляторной ответной реакцией на инъекции гонадотропинов. Выбракованные коровы могут использоваться в качестве доноров только при их высокой племенной и товарной ценности в предыдущие годы, хорошем здоровье и при условии, что причина выбраковки не связана с понижением воспроизводительной способности. Не исключается возможность использования в качестве доноров телок старше 15-месячного возраста при условии их происхождения (следует, однако, иметь в виду, что нелактирующие животные имеют худшую реакцию на гонадотропные гормоны, чем лактирующие).

Отбор доноров проводят комиссивно с оформлением на каждое животное или группу животных ветеринарного свидетельства. Хозяйство, в котором проводят отбор коров-доноров, должно быть благополучным по бруцеллезу, туберкулезу, паратуберкулезному энтериту, лейкозу, хламидиозу, кампилобактериозу, вирусным респираторным заболеваниям, инфекционному ринотрахеиту, пустулезному вульвовагиниту, ящуру, другим заразным болезням. Животные должны быть вакцинированы в соответствии с планом противоэпи-зоотических мероприятий. Каждого предполагаемого донора подвергают тщательному клиническому обследованию. При гинекологическом исследовании определяют состояние половых органов животных. В число доноров не включают животных, у которых были тяжелые роды, задержание последа, мастит, послеродовые заболевания, дисфункция яичников и матки, а также у которых выявлены гинекологические болезни, истощение, расстройство обмена веществ и другие патологические процессы. Необходимо определить продолжительность полового цикла у отбираемых коров. Животных с неполноценным половым циклом, анафродизией исключают из числа доноров, коров, поступивших из других хозяйств, предварительно вакцинируют.

Гормональную обработку (стимуляцию суперовуляции) начинают через 2—3 мес после отела. Нереагирующих на гормональную обработку животных из числа доноров исключают. Следует иметь в виду значительную вариабельность реакции доноров на суперовуля-торную обработку: до 20—40% коров-доноров не продуцируют жизнеспособных эмбрионов; около /3 доноров приходится выбраковывать. При планировании трансплантации исходят из возможности получения от каждой коровы-донора за одну обработку в среднем пяти полноценных эмбрионов. Количество обработок донора в течение года регулируют в зависимости от потребностей в реакции на обработку. По мнению Н.И. Кирилловой и др. (1986), для многократного использования в качестве доноров пригодны коровы, которые хорошо реагируют на гормональные обработки и дают не менее пяти нормальных эмбрионов на первое и второе извлечение.

Нет единого мнения о кратности использования доноров. Повторно их можно использовать не раньше, чем через 1,5—2 мес после очередного вымывания. Как правило, примерно через 30 сут после вымывания эмбрионов у коров-доноров возобновляется стадия возбуждения полового цикла. В США принято повторную гормональную обработку коров-доноров проводить, пропустив два половых цикла после вымывании эмбрионов. Во Франции на 7-е сут после извлечения эмбрионов доноров обрабатывают простаглан-дином, затем пропускают один-два цикла, после чего с 8—12-х сут очередного цикла начинают снова обрабатывать доноров. В СССР рекомендовалось для получения эмбрионов коров-доноров использовать два-три раза с интервалом 45—60 сут, после чего возвращать в стадо для естественного воспроизводства. На протяжении этого срока их обеспечивают полноценным кормлением, ограничивая дачу силоса и концентратов; ежедневно предоставляют активный моцион.

Уместно заметить, что при однократном использовании коровы в качестве донора период от отела до оплодотворения у нее увеличивается до 40 сут, а при многократном — на соответственно большее число дней (Н.И. Кириллова и др., 1986). Гормональная обработка коров может снизить у них молочную продуктивность и даже прекратить ее. Для восстановления удоя донорам можно делать инъ-

екции синтетических аналогов простагладина Ф-2 альфа (эстрофана, энзапроста, эструмата).

В качестве реципиентов используют малоценных в племенном отношении коров (лучше не старше шести лет) и телок любой породы средней упитанности (живой массой 340—380 кг; лучше помесных) в возрасте 16—20 мес. Животные-реципиенты должны быть хорошо развитыми, клинически здоровыми, без патологических изменений в половой сфере и расстройств обмена веществ, с выраженной половой цикличностью. Диагностическими исследованиями у них должны быть исключены бруцеллез, трихомоноз, камнилобак-териоз, лейкоз, ринотрахеит, лептоспироз, хламидиоз, паратуберкулез и другие заразные заболевания.

Рекомендуемое состояние доноров и реципиентов — 1 : 5—10. Эффективность трансплантации эмбрионов в значительной степени зависит от синхронности половой цикличности у доноров и реципиентов. Поэтому надо точно определять у них время проявления фазы половой охоты, продолжительность полового цикла.

Нормальная воспроизводительная способность животных и получение хорошо развитого приплода в значительной мере обеспечиваются полноценным сбалансированным кормлением доноров и реципиентов с учетом их физиологического состояния и продуктивности. Согласно нормам кормления рацион животных должен быть сбалансирован по энергии, протеину, углеводам, макро- и микроэлементам, витаминам при их оптимальном соотношении. Кормят доноров и реципиентов по индивидуальным рационам, правильно подбирая разнообразные высококачественные корма. Особое внимание следует уделять кормлению сухостойных коров: их рацион должен состоять из сена хорошего качества и минимального количества сочных, зеленых и концентрированных кормов.

Содержат коров-доноров в светлых сухих помещениях, в индивидуальных боксах (3,5 х 4 м), а реципиентов — в просторных стойлах. Коров ежедневно чистят, предоставляют им 3—4-часовой активный моцион. Очень важно поддержание на ферме высокой санитарной культуры.

Методы вызывания суперовуляции. Множественная овуляция у доноров вызывается с помощью их гормональной обработки с учетом особенностей нейрогуморальной регуляции у них половых процессов. В частности, вызывание суперовуляции у доноров базируется на повышении содержания в их крови ФГС, стимуляции за счет этого созревания многих фолликулов; индукции в соответствующий момент регрессии желтого тела и овуляции максимального количества зрелых фолликулов. С этой целью используют: нативную сыворотку жеребных кобыл (СЖК), кеофилизированную сыворотку жеребных кобыл, очищенную от балластных белков (ГСЖК), или зоо

фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), полученный из гипофиза животных, в сочетании с лютеолитическим гормоном (синтетическим аналогом простогландина Ф-2 альфа-эстрофаном, экзопростом, эстрафуланом и др.).

СЖК и ГСЖК — препараты, содержащие гонадотропные гормоны, которые по своим биологическим свойствам гонадотропны гормонам передней доли гипофиза. Сывороточный гонадотронин обладает фолликулостимулирующим и лютенизирующим эффектом, причем первый в 2—3 раза сильнее второго. Активность СЖК (ГСЖК) измеряется в интернациональных или мышиных (МЕ) единицах. Одна интернациональная единица (или 2,5 МЕ) приравнивается к 0,25 мг стандартного препарата. Гормональный титр сыворотки, определенный по содержанию в ней гонадотропинов, колеблется от 60 до 300 ИЕ в 1 мл и обычно составляет 120—180 ИЕ в 1 мл нативной сыворотки.

Коровам-донорам ГСЖК инъекцируют подкожно однократно в середине полового цикла при наличии в одном из яичников хорошо развитого желтого тела. Суперовуляторная доза составляет 200—300 ИЕ (увеличение дозы влечет возрастание числа овулировавших фолликулов, но сопровождается ростом количества неопло-дотворенных и дегенерированных яйцеклеток, чревато кистообра-зованием в яичниках). Через 40—48 ч — эстрофан или эструмейт — 500 мкг. При этом получают 6—7 овуляций на донора. Можно вводить экзопрост — 30 мг. У большинства животных через 48 ч после инъекции простагландина появляется охота.

Следует, однако, отметить, что на введение ГСЖК суперовуляцией реагирует 40—70% коров. У остальных появляются атипичные реакции: отсутствие роста фолликулов, небольшое число овулиро-ванных фолликулов, формирование фолликулярных кист. Наряду с этим после такой обработки отмечаются снижение оплодотворяе-мости, нарушения в развитии зиготы. Эти отрицательные последствия объясняют гормональным дисбалансом, так как экзогенные гонадотропины СЖК сохраняют биологическую активность в организме самок в течение двух недель.

С целью исключения длительного воздействия гонадотропинов СЖК на яичники предложено применять антисыворотку на гонадотропины: донора обрабатывают антисывороткой спустя четыре дня после инъекции ГСЖК. При этом, по сообщению Н.И. Сергеева (1986), реагируют суперовуляцией 9,2; выход нормальных эмбрионов с 1,8 возрастает до 4,1. Однако такие результаты достигаются после первых двух обработок ГСЖК; число животных, реагирующих на третью обработку, снижается на 50%, выход годных для пересадки эмбрионов уменьшается до 2,8 на прореагировавшего донора. Более стабильные результаты дает стандартный препарат СЖК (фоллигон) в сочетании с антисывороткой чехословацкого или бельгийского производства: суперовуляцией при этом реагируют около 90% доноров, на каждого из них получают в среднем 7,4 овуляции.

Более эффективно применять фолликулостимулирующий гормон (ФСГ-П) с 9-х по 12-е сут полового цикла. Преимуществом этого препарата является то, что при многократной (5—8 раз) обработке число овуляций и нормальных эмбрионов не снижается, а в отдельных случаях даже возрастает. В связи с быстрой инактивацией в организме ФСГ-П вводят дробными дозами (расход препарата на курс обработки — 32—50 мк). Предложено несколько вариантов использования ФСГ-П. Так, В.П. Беляев и др. (1988) получили хороший суперовуляторный ответ при применении ФСГ-П с интервалом 12 ч в убывающих дозах: 8 + 8 + 8 + 5 + 3 + 3 + 2 + 2 мг; через 48 ч от начала обработки корове-донору инъекцировали эстрофан в дозе 2 мг (500 мкг), при этом полиовуляцией реагировало свыше 71% коров со средним числом овуляций 8,7 (извлечено 6,5 эмбриона на донора, из которых 4,8 полноценных). Эстрофан лучше вводить дважды с промежутком 12 ч: первый раз — 500 мкг, второй — 250 мкг.

Следует иметь в виду, что около 30% животных не реагируют на ФСГ.

Если обработку коров-доноров проводить с учетом индивидуальной реактивности организма на гормональные препараты, суперовуляторный ответ животных можно повысить (В.В. Мадиссон, С.Н. Крылов, 1986). Выявлена положительная связь эмбрионопро-дуктивности и молочной продуктивности у коров-доноров: от коров с более высоким уровнем молочной продуктивности получали эмбрионов больше, чем от менее продуктивных животных.

Установлена значительная вариабельность суперовуляции (от 1 до 100 фолликулов) в зависимости от вида, качества, дозы, времени, кратности применения препарата, метода обработки животных, таких генетически детерминированных факторов, как уровень фол-ликулогенеза, количество первичных фолликулов, способных реагировать на гормональную обработку, иммунная реактивность организма, а также от породной принадлежности, возраста, лактационного статуса, состояния здоровья животного, размеров яичников и их чувствительности к гонадотропину, условий кормления и содержания доноров (Яблонский В.А., 1988).

Существует несколько схем обработки коров-доноров.

Схема 1. 10—12-е сут полового цикла — нативный препарат ГСЖК - 3000-3800 ИЕ, хормогон в смеси с ГСЖК - 500 ИЕ; 12-14-е сут — простагландин — 500—30 мкг/мг; 14—16-е сут — охота, осеменение; 21—23-е сут — извлечение эмбриона.

Схема 2. 2-е сут полового цикла — витамин А — 150 000 МЕ, витамин Е— 100 мг, водистый калий — 100—200 мг; 10—12-е сут — на-

тивный препарат ГСЖК — 3000—3800 ИЕ, витамин А — 7500 ИЕ, витамин У — 50 мг; 12—14-е сут — простагландин — 500—30 мкг/мг; 14—16-е сут — охота, осеменение; 21—23-е сут — извлечение эмбрионов.

Схема 3. 8-е, 9-е, 10-е, 11-е, 12-е сут полового цикла — ФСГ-П — по 10 мг; 13-е сут — охота, осеменение; 20-е сут — извлечение эмбрионов.

При так называемом методе вызывания суперовуляции на 16— 17-е сут полового цикла корове вводят 1500—3000 ИЕ ГСЖК. Уже на 2-е сут у животных появляется охота. Чтобы ее легче выявлять, на 10-е и 20-е сут им вводят по 10 мг экстрадиола бензоата, а на 21-е сут — в день охоты — внутривенно 1500—300 ИЕ хориального гонадотропина.

Как уже упоминалось, в настоящее время обработку гонадотропинами проводят в лютеиновую фазу цикла. При этом сначала донорам вводят простагландин (однократно или, что лучше, двукратно с промежутком в 11 сут), определяют время появления охоты (примем эти сутки за «нулевые») и на 8—13-е сут после этого, т.е. в активную лютеиновую фазу, инъекцируют 1500—3000 ИЕ ГСЖК. На этом принципе основывается «датский» метод применения про-стагландина (или его аналога), вызывающего лютеолистический эффект и овуляцию.

Для увеличения выхода эмбрионов и их биологической полноценности коровам-донорам вводят также витаминные препараты (А — 120—150 тыс. МЕ, Е — 80—100 мг), микроэлементы (йодистый калий — ежедневно с кормом по 100—200 мг).

Французская схема подготовки доноров предусматривает предварительную синхронизацию у них охоты с помощью синхромата Б (новый простагландин, содержащий в своем составе аналог прогестерона и эстрадиола). Препарат имплантируют донору под кожу уха. На 9-е сут имплант удаляют. На 11-е сут у животного наступает охота. На 10—22-е сут доноров осеменяют и на 33-е сут извлекают эмбрионы.

Ярко выраженная охота у доноров свидетельствует о хорошей реакции их яичников на гормональные препараты. Установить приблизительное количество созревших фолликулов в процессе осеменения трудно. Лучше это сделать после овуляции по количеству образовавшихся желтых тел и числу извлеченных эмбрионов и яйцеклеток.

При отсутствии у коров реакции на гормональную обработку их исключают из числа доноров.

Чтобы вызвать суперовуляцию у овец-доноров им вводят на 12— 13-е сут полового цикла сывороточный гонадотропин 700—1500 ИЕ. Охота наступает через 2—4 сут, у 74—100% обработанных овец наблюдается суперовуляция. В начале течки можно вводить внутривенно

зоз

500—100 ИЕ ХГЧ (хорионического гонадотропина) (Влахов К.Н., 1982). Неплохие результаты получают при введении на 11-е сут полового цикла 12 000 ИЕ СЖК, а через 68 ч — 260 мкг простагландина. При этом происходит от 3 до 38 овуляций (Аверилл Р.Л., 1958; Сергеев Н.И. идр., 1984).

У свиней суперовуляцию вызывают применением ГСЖК в дозе 600—800, при этом число овуляций достигает 33—38. Для стимуляции полиовуляции у кобыл им вводят 2000—3000 ИЕ ХГЧ.

Осеменение самок-доноров. После гормональной обработки самок-доноров в период стадии полового возбуждения (во время фазы половой охоты до наступления овуляции) их подвергают осеменению. В настоящее время воспроизводство стада сельскохозяйственных животных базируется на широком использовании метода искусственного осеменения.

У коров, обработанных гонадотропинами в фолликулиновую стадию (на 15—16-е сут полового цикла), охота наступает через 3— 7 сут. У коров же, подвергнутых комбинированной обработке гонадотропинами и простагладином Ф-2 альфа в лютеиновую фазу полового цикла, охота наступает через 36—75 ч после инъекции простагландина и длится в среднем 24 ч (до 36—48 ч). Для ее обнаружения проводят пробу на охоту через каждые 3—4 ч. Овуляция начинается спустя 54—60 ч после введения простагландина; она растягивается до двух суток. Искусственно осеменять коров надо через 8—12 ч после обнаружения охоты (Ньюкомб, 1980 — не позже 48 ч после применения простагландинов), повторно — через 12 ч; при затянувшейся охоте проводят третье (а возможно, и четвертое) осеменение через такой же промежуток времени. Если начало охоты не удалось установить, корову-донора осеменяют в фиксированное время — через 56 и 72 ч после инъекции простагландина.

Для искусственного осеменения коров-доноров используют высококачественную сперму быков-производителей, оцененных по качеству потомства и признанных улучшателями. Применяют цервикальный способ искусственного осеменения с ректальной фиксацией шейки матки; в дозе вводимой спермы должно быть не мене 40—50 млн активных спермиев.

Искусственное осеменение овец проводят: в августе-сентябре — для получения зимнего ягнения и в октябре-ноябре — для достижения весеннего ягнения с завершением всей работы в течение 35—40 сут. Отбор маток в охоте начинают рано утром при помощи баранов-пробников. Осеменяют овцематок в период охоты дважды: утром — вскоре после установления у них феномена охоты, повторно — вечером того же дня или (при продолжающейся охоте) на следующее утро. Искусственное осеменение осуществляют визоцер-викальным способом с использованием влагалищного зеркала и стеклянного шприца-катетера или шприца-полуавтомата. Вводят в цервикальный канал на глубину 1—2 см от 0,06 (свежеполученной) до 0,1—0,2 мл (разбавленную) сперму с содержанием в дозе не менее 50 млн активных спермиев (активность спермиев свежеполученной спермы должна быть не менее 8 баллов, сохраняемой кратковременно — не ниже 7 баллов).

Искусственное осеменение свиней проводят в следующие сроки:

  • 1) при трехкратном в течение дня выявлении у свиноматок фазы половой охоты — однократно в среднем через 24 ч после начала охоты;
  • 2) при двукратном в течение дня выявлении у свиноматки охоты — первый раз — спустя 12 ч после установления признаков охоты, повторно — через 12 ч; 3) при однократном в течение дня выявлении свиноматок в фазе половой охоты (утром) — сразу после ее установления и повторно через 24 ч.

Применяют два способа внутриматочного искусственного осеменения: 1) осеменение разбавленной спермой по технологии ВИЖ при помощи прибора ПОС-5 (вводят сперму в объеме 1 мл на 1 кг массы животного, но не более 150 мл, содержащую 3—5 млрд активных спермиев); 2) фракционный способ осеменения при помощи универсального зонда УЗК-5 (вводят 40—50 мл неразбавленной или слегка разбавленной спермы, содержащей 2—3 млрд активных спермиев, а затем от 70—80 до 100 мл солевого раствора). Для осеменения используют сперму активностью: свежеполученную — активностью не менее 7 баллов, кратковременно сохраняемую — активностью не менее 6 баллов.

Искусственное осеменение кобыл проводят при наличии у них фолликула 3-й и 4-й стадий зрелости (при ярком проявлении признаков охоты 3-й и 4-й ступени) и повторяют каждые 24 ч до наступления овуляции и затухания признаков охоты. Осеменяют кобыл внутриматочно при помощи резинового или эбонитового катетера со стеклянным шприцем вместимостью 30—40 мл. В дозе спермы (от 25 до 45 мл) должно быть не менее 300 млн активных спермиев. Активность спермиев должна быть: в свежеполученных эякулятах — активностью не менее 6 баллов, в замороженной и оттаянной сперме — активностью не менее 2 баллов.

Извлечение эмбрионов. Так как при суперовуляции фолликулы вскрываются не одновременно, то и оплодотворение яйцеклеток и прохождение их по яйцеводу растягивается во времени. На 4— 5-е сут основное количество эмбрионов перемещается из яйцепро-вода в рог матки, хотя около 10% из них могут задерживаться в яйцепроводе до 8-х сут. Постепенно эмбрионы смещаются от верхушки рога матки к его передней части и на 7—8-е сут здесь оказывается около 73% их количества, примерно 20% задерживается в средней

части рога, а 7% — в яйцепроводах. До 8—9-х сут эмбрионы пребывают в свободном состоянии.

У коров-доноров на шестые-седьмые сутки после осеменения осторожной пальпацией через прямую кишку подсчитывают количество желтых тел, определяют степень их развития. После этого эмбрионы извлекают. Извлечение эмбрионов у животных-доноров можно осуществлять двумя методами: хирургическим и нехирургическим.

До середины 1970-х гг. эмбрионы у коров извлекали в основном хирургическим методом, добывая их из яйцевода или рога матки, в зависимости от того, на какой стадии проводили операцию. При применении хирургического метода донора выдерживают 1—1,5 сут на голодной диете, а за 6 ч до операции исключают водопой.

Предложено несколько оперативных доступов: по белой линии живота, в области голодной ямки (слева или справа), через верхний слой влагалища.

Хирургическое извлечение эмбрионов путем лапаротомии по белой линии чаще проводят у телок, в условиях хорошо оборудованной клиники.

Премедикация включает внутимышечную инъекцию 2 мл рам-пуна, 4 мл 0,1 %-го раствора атропина или 4 мл комбелена. Животное фиксируют на операционном столе в спинном положении. Операцию проводят под общим наркозом (внутривенно 10%-й раствор хлоралгидрата из расчета 100 мл на 100 кг массы животного). После обезболивания и подготовки операционного поля делают разрез живота длиной от 15 до 30 см по белой линии как можно ближе к тазу (спереди молочной железы). Осуществив разрез брюшины, вводят руку в брюшную полость, отыскивают и извлекают один рог матки вместе с яйцепроводом и яичником, в котором подсчитывают количество желтых тел. Тело фиксируют в раневом отверстии. Для извлечения эмбриона матку промывают большим количеством жидкости. Вымывание эмбрионов можно проводить маточным или маточно-яйцепроводным способом. В обоих случаях сначала делают небольшой разрез стенки рога матки вблизи ее тела, через него вставляют катетер Фолли и продвигают к верхушке рога. В баллончик-манжетку катетера нагнетают 20—30 см воздуха.

При использовании маточного способа прокалывают верхушку рога матки иглой, через нее вводят шприцем подогретую до 37°С промывную жидкость — среду Дюльбекко с добавлением 1%-го бычьего альбумина или стерильной сыворотки (в просвет рога вводят порционно до 120 мл жидкости). Вытекающую через катетер Фолли промывную жидкость собирают в стерильный флакон (пробирку) вместимостью 150 мл. Аналогично поступают с другим рогом матки.

зоб

Маточно-трубный способ отличается тем, что для вымывания эмбрионов тупую иглу с эластичным шлангом (резиновую или стеклянную канюлю) вставляют в ампулу яйцевода со стороны воронки и через нее подают промывную жидкость, которая проходит через яйцепровод, рог матки и по катетеру Фолли (рис. 12.6) попадает в стерильный сосуд.

Катетер Фолли

Рис. 12.6. Катетер Фолли

Хирургическое извлечение эмбрионов путем лапаротомии в области голодной ямки является наиболее простым и наименее трудоемким методом. Его можно проводить под местной анестезией.

Корову-донора фиксируют в стоячем положении, по общепринятым хирургическим принципам подготавливают операционное поле. Премедикацию проводят путем внутимышечного введения 0,7 мл рампуна. Применяют паралюмбальную анестезию 2%-м раствором новокаина (по И.И. Магда) в сочетании с инфильтрационной анестезией по линии разреза брюшной полости. Последний начинают на уровне тазобедренного сустава, отступив от него вперед на 2 см (на расстоянии 8 см спереди линии коленного сустава между наружным бугром подвздошной кости и задним краем ребра, на 10 см ниже поперечно реберных отростков поясничных позвонков). Вымывание эмбрионов проводят так же, как описано выше.

Закончив вымывание, матку возвращают на место, брюшную полость орошают физраствором, вводят в нее 1 млн ЕД пенициллина и стрептомицина, рану брюшной стенки припудривают порошком трициллина и зашивают с последующей обработкой раствором йода и наложением клеевой повязки. Через две недели швы снимают.

Хирургический метод извлечения эмбрионов через разрез верхнего свода влагалища (трансвагинальный метод) применяется в тех случаях, когда вследствие анатомических особенностей строения шейки матки нельзя осуществлять нехирургическое извлечение эмбрионов. Такой метод пригоден лишь для одноразового использования донора.

Животное фиксируют в станке и подсчитывают количество желтых тел в каждом яичнике. Перинеальную область моют мыльным раствором, дезинфицируют 70%-м спиртом. Премедикацию проводят путем внутимышечной инъекции 0,7 мл рампуна, 4 мл комбелена или 4 мл 0,1%-го атропина и эпидурального введения 5—10 мл 2%-го раствора новокаина между последним крестцовым и первым хвостовым позвонками. Через 10—15 мин отводят хвост в сторону, фиксируют его с помощью бинта; внутреннюю поверхность влагалища орошают 2%-м раствором диоцида. Тщательно моют руку мылом со щеткой, обрабатывают ее раствором нашатырного спирта и протирают 5%-м раствором йода. Берут в руку скальпель, зажимают его между сложенными конусом пальцами и вводят ее во влагалище. Делают с одной стороны шейки дорзальный разрез свода влагалища длиной 2—3 см. Извлекают из влагалища скальпель, через разрез вводят в брюшную полость сначала два пальца, затем поочередно остальные и всю руку. Специально подготовленной тупой иглой диаметром 1 — 2 мм прокалывают возле бифуркации рог матки, соединенный с яичником, содержащим желтые тела. Через образовавшееся отверстие вводят конец катетера с баллончиком для вымывания эмбрионов. Нагнетают в баллончик 7—10 см3 воздуха, с помощью шприца вливают в рог матки промывную жидкость температурой 37°С и отсасывают ее обратно. Продолжительность промывания — 25—30 мин; при этом удается собрать около 70% эмбрионов.

Для трансвагинального извлечения эмбрионов также можно использовать специальный инструмент, состоящий из металлической канюли с двумя латеральными отверстиями, соединенной с латексным катетером Фолли. Надевают на средний палец кольцо инструмента и вводят руку через разрез влагалища в брюшную полость. Доходят до нижней трети рога матки, вставляют канюлю в его просвет и производят вымывание. Во время промывания вынимают палец из кольца, приподнимают верхушку рога и передавливают пальцами маточно-трубное соединение. Рана в стенке влагалища заживает примерно через 4 сут после операции.

Животное фиксируют в станке. Делают продольный разрез свода влагалища и через него вводят осторожно кастрационные шприцы или эфеменатор. Захватывают рукой подлежащий удалению рог матки вместе с яйцепроводом, брыжейкой и яичником и вкладывают его в раскрытый прибор. Проверив правильность размещения удаляемого участка гениталий, легким нажатием руки закрывают эфе-минатор и быстро завинчивают барашковую часть гайки, отделяют ампутированную часть и удаляют ее из брюшной полости. Пережимают культю рога матки кровоостанавливающим пинцетом. Аналогично удаляют второй рог матки. Эфеменатор оставляют закрытым на 5 мин, затем вынимают вместе с ампутированными тканями. Вводят в брюшную полость через разрез влагалища смесь антибиотиков.

Ампутированные ткани переносят в лабораторию, осматривают их, подсчитывают количество желтых тел и неовулировавших фолликулов, промывают со стороны яйцепровода в направлении открытого конца рога матки, собирая промывную жидкость в стерильные чашки Петри. На промывание одного рога расходуют 20—60 мл, яйцепровода — около 10 мл среды.

Извлечение эмбрионов из гениталий убитых животных — самый простой метод. На бойне (мясокомбинате) вынимают из убитых животных половые органы, доставляют их в лабораторию, где в зависимости от времени, прошедшего после осеменения, промывают описанным выше методом рога матки или яйцепровода. Вымывание эмбрионов из множества убитых животных бывает эффективным, если после убоя прошло не более 2—2,5 ч.

Хирургические методы сложны, трудоемки, их можно использовать в отношении одного животного не более трех раз.

Нехирургическое извлечение эмбрионов — наиболее приемлемый для практических условий (на животноводческих фермах) метод.

Перед вымыванием эмбрионов донора желательно выдержать 12 ч на голодной диете. Животное фиксируют в станке, делают низкую эпидуральную анестезию, прямую кишку освобождают от фекалий. Определяют количество желтых тел в каждом яичнике. Хвост бинтуют, подвязывают к шее животного. Область наружных половых органов и промежность моют теплой водой с мылом, высушивают салфеткой и дезинфицируют 70%-м этиловым спиртом или аэрозолем «Септонекс». Оптимальным сроком нехирургического извлечения эмбриона являются седьмые-восьмые сутки после осеменения, когда он расположен в передней и средней части рога матки, а маточно-яйцепроводное соединение плотно закрыто.

Под контролем руки в полиэтиленовой перчатке, находящейся в прямой кишке, двухходовый урологический катетер Фолли со вставленным металлическим стилетом вводят в цервикальный канал. Его направляют в один из рогов матки, продвигая до тех пор, пока баллон-манжетка не окажется за бифуркацией, а конец катетера достигнет верхушки рога. Стилет извлекают. В баллон-манжетку нагнетают 15—20 см3 воздуха для фиксации катетера и ограничения промывной полости. Затем к катетеру присоединяют шприц, открывают кран и под умеренным давлением вводят в рог матки порционно 20—60 мл физиологической жидкости (фосфатный буфер Дюль-бекко с добавлением 1%-й эмбриональной сыворотки, или бычий сывороточный альбумин (4 мг/мл), или среду ТСМ-199, а также 0,06 мг/мл сульфата дигидрострептомицина в 100 ЕД пенициллина), имеющего температуру 37,3—38°С. Рог матки осторожно массируют, чтобы отделить эмбрионы от его стенок. Кран переключают, промывную жидкость сливают в стерильный сосуд. Порционное вымывание повторяют 4—7 раз, общий расход физиологической среды на один рог составляет 200—500 мл. При вымывании учитывают объем раствора, полученного из матки, так как с его уменьшением снижается количество вымытых эмбрионов. Основную часть эмбрионов обнаруживают в первых трех смывах. По завершении процедуры катетер переводят в другой рог, откуда таким же способом извлекают эмбрионы.

Французской фирмой ИМ В предложен трехканальный катетер с гибким телескопическим зондом с канюлей. Зонд хранят и транспортируют в разобранном виде в воздушной пароформалиновой камере (футляре из нержавеющей стали или пластмассы с таблетками пароформа). После работы зонд и гибкие трубки промывают дистиллированной водой, высушивают продуванием воздуха через гибкие соединительные трубки.

В.П. Белевич (1986) сконструировал безманжетный одноканальный катетер, позволяющий извлекать около 75% эмбрионов у доноров. Ф.И. Осташко совместно с другими учеными предложил устройство для асептического получения эмбрионов, их поиска, оценки и хранения. Усовершенствованный способ вымывания эмбрионов у коров посредством замкнутой гидростатической системы и четырехходового крана описан И. X. Хабибулиным (1986).

После окончания вымывания эмбрионов в полость матки вводят раствор антибиотиков. Через 4—5 сут корове-донору инъекцируют простагландин Ф-2 альфа с целью предотвращения очередной стадии возбуждения полового цикла. При использовании нехирургического метода извлекают 42—50% эмбрионов (свыше пяти полноценных эмбрионов на донора).

Эмбрионов у овец извлекают только хирургическим способом под общим наркозом или с местной анестезией путем лапаротомии по белой линии живота. В зависимости от применяемого метода эмбрионы вымывают из яйцепровода (до 3-х сут) или из рога матки (с 3-х по 6-е сут). По данным Л. Роусона (1971), из яйцепровода можно вымывать практически все эмбрионы, а из рогов матки — до 90%.

Эмбрионов у овец вымывают хирургическим методом, с лапаротомией, гистерэктомией, после убоя донора. При этом используют пуговчатую канюлю, пластиковый или стеклянный катетер с введением промывной жидкости через яйцепровод, маточно-трубное СОединение, верхушку рога матки и промыванием в направлении шейки матки. Производят вымывание и пересадку эмбрионов начиная со стадии неразделившейся зиготы и до стадии бластоцисты, т.е. через 1—5 сут после осеменения.

Эмбрионов у кобыл-доноров вымывают как хирургическим, так и нехирургическим методом. Хирургическое получение эмбрионов осуществляется путем лапаротомии по белой линии. На ипсилате-ральный рог матки накладывают лигатуру и вводят катетер. С помощью спринцовки вводят в яйцепровод 30—50 мл среды, что позволяет вымыть 77% эмбрионов на 1—6-е сут после осеменения. Можно извлекать эмбрионы и на 7—8-е сут после овуляции нехирургическим путем, используя методы, применяемые в скотоводстве. Есть сообщения об использовании удлиненного катетера Фолли (Имель К. и др., 1981), причем промывание матки проводится раствором Крабса—Рингера, Пракера, Цюльбекко и др.

Технология работы с эмбрионами. Сначала проводят поиск эмбрионов и оценку их качества. Собранную в стеклянный цилиндр промывную жидкость с эмбрионами накрывают алюминиевой фольгой, передают в стерильный бокс, где в термостате при 37°С в течение 30 мин отстаивают. Лучше отстаивать промывную жидкость в оснащенных краниками конических сосудах, делительных воронках или сосудах со специальными ситечками для эмбрионов. В боксе должна быть температура 25—28°С. Здесь ежедневно проводят влажную уборку, за 1—2 ч до работы с эмбрионами поверхность приборов, оборудования, стен протирают 70%-м спиртом; включают бактерицидные лампы. Персонал обязан работать в стерильных халатах, шапочках и сменой обуви, пользоваться чистыми, стерильными посудой и инструментами. Руки перед работой обрабатывают тампоном, смоченным 70%-м спиртом. Для избежания загрязнения промывной жидкости и эмбрионов согласно французской технологии все манипуляции с эмбрионами проводят под ламинарным потоком отфильтрованного воздуха в специальных шкафах, нисходящие потоки воздуха в которых препятствуют проникновению микрофлоры.

При работе с эмбрионами используют различные среды, которые готовят заблаговременно (осмотическое давление растворов должно составлять 300 моем, pH 7,2—7,6). Наиболее распространенной из них является фосфатно-буферная среда Дюльбекко, в 1 л которой непосредственно перед применением добавляют 4 г бычьего альбумина (его можно заменить инактивированной в течение 20 мин при 56°С сывороткой крупного рогатого скота или овцы, которую добавляют из расчета 20% объема среды), 1,0 г глюкозы, 0,036 г пирувата натрия и 100 тыс. ЕД бензилпенициллинкалиевой соли. Эту же среду используют для кратковременного хранения эмбрионов.

После отстаивания промывной жидкости с помощью сифона отсасывают ее верхний слой. Нижний слой — осадок (50—100 мл) осторожно разливают небольшими порциями (по 20—30 мл) в чашки Петри диаметром 100 мм или круглодонные чашки, дно которых для удобства расчерчено на квадраты размером 1 х 1 см, и исследуют под бинокулярной лупой или стереоскопическим микроскопом (МБС-9) при 15—25-кратном увеличении. Обнаруженные эмбрионы вылавливают микропипеткой и помещают в чашку Петри диаметром 40 мм с питательной средой (раствором Дюльбекко или средой ТСМ-199 с добавлением эмбриональной сыворотки).

Поиск бывает затруднен из-за наличия включений (атипичных клеток, слизи, сгустков крови). С целью облегчения этого процесса в НИИ животноводства лесостепи и полесья УССР предложили после предварительного просмотра и извлечения эмбрионов проводить гомогенизацию осадочной жидкости, вращая ее в гомогенизаторе со скоростью 3—5 тыс. об/мин в течение 4—6 мин. Это позволяет существенно снизить оптическую плотность смывов и при повторном поиске обнаружить около 20% эмбрионов.

После завершения поиска эмбрионов приступают к оценке их качества с использованием инвертированного микроскопа. При исследовании эмбрионов учитывают: соответствие стадии развития эмбриона его возрасту, форму эмбриона, состояние (целостность) прозрачной оболочки, равномерность дробления, число и величину бластомеров, состояние цитоплазмы, прозрачность перивителлино-вого пространства. Как было указано ранее, количество бластомеров в развивающемся эмбрионе удваивается примерно каждые 24 ч. Если, например, на 2-е сут их было 2, то на 3—4-е — 4—8 и т.д. На 4—7-е сут они достигают стадии морулы, 7—8-е — ранней бластоцисты, 8—9-е — бластоцисты, 9—10-е — поздней бластоцисты, 10— 11-е — эмбрион выходит из прозрачной оболочки. Вследствие некоторой растянутости суперовуляции и неодновременности оплодотворения яйцеклеток в промывной жидкости могут обнаруживаться эмбрионы разного возраста.

Биологически полноценные эмбрионы (8-суточные) имеют четкую шарообразную (правильную сферическую) форму, диаметр 120—200 мкм, ясно выраженные трофобласт и эмбриобласт, одинаковый размер бластомеры с плотным межклеточным комплексом, обусловливающим компактность эмбриона. Неполноценными считают эмбрионы, содержащие бластомеры разных размеров с нечеткими клеточными мембранами и другими признаками дегенерации.

В промывной жидкости могут также обнаруживаться неоплодот-воренные яйцеклетки в состоянии дегенерации, со сморщенной, неровной формы цитоплазмой, а также зародыши неправильной формы с нарушением целости прозрачной оболочки, ее разрывами, расслоениями, сжатием полости, неравномерным дроблением, нарушением связи клеток, грануляцией цитоплазмы.

Резко отстающие от нормального развития эмбрионы с выраженными признаками асинхронности дробления бластомеров, их дегенерации не пригодны для трансплантации, тогда как эмбрионы с небольшими морфологическими изменениями считаются условно пригодными.

Значительно большие изменения наблюдаются у сохраняемых в замороженном виде эмбрионов; замораживание и оттаивание накладывает специфический отпечаток на структуру эмбрионов, поэтому их оценка бывает затруднена. Не всегда удается точно определить полноценность 7—8-суточных эмбрионов вследствие их мно-гоклеточности. Дегенерация эмбрионов начинается еще на стадии морулы во время их продвижения по яйцепроводу, однако морфологически это проявляется на более поздних стадиях, когда они оказываются в роге матки.

Греве (1980) предлагает оценивать эмбрионы по следующим показателям (рис. 12.7).

Эмбрионы крупного рогатого скота

Рис. 12.7. Эмбрионы крупного рогатого скота

Жизнеспособные эмбрионы — это эмбрионы, стадия развития которых соответствует их возрасту, исчисляемому со дня охоты. Такие эмбрионы имеют сферическую форму без признаков лизиса, вздутия, вакуолизации или дегенерации отдельных бластомеров. Извлеченные на 6—8-е сут эмбрионы чаще всего находятся на стадии поздней морулы, бластоцисты в начальной или поздней стадии расширения бластоцелия и, что встречается реже, в стадии вылунив-шейся бластоцисты. Они являются наиболее подходящим для трансплантации синхронизированным реципиентам.

Замедленные (ретардированные) эмбрионы — это эмбрионы, которые оказываются на более разных стадиях развития, чем ожидалось согласно их возрасту. Считают, что они отстали в развитии или получены от позже овулировавших фолликулов. При их трансплантации синхронизированным реципиентам они имеют меньше шансов на приживление и продолжение развития.

Уродливые (дегенерированные) эмбрионы — это эмбрионы, характеризующиеся разорванными, вздутыми, или вакуолизирован-ными, бластомерами или лизированной цитоплазмой. Такие эмбрионы не используют при трансплантации.

Неоплодотворенные яйцеклетки — гомогенные яйцеклетки без наличия бластомеров и перивителлинового пространства. Иногда обнаруживается одно полярное тельце.

Райт (1984) классифицирует эмбрионы по морфологическим признакам на три класса:

  • 1) нормальные;
  • 2) с незначительными отклонениями;
  • 3) с увеличенным количеством дегенерированных клеток.

Элсден с другими учеными (1978) разделяет эмбрионы на четыре

класса: плохие, средние, хорошие и отличные.

В НИИ животноводства лесостепи и полесья Украины предложили 5-балльную систему оценки эмбрионов по морфологическим признакам; она предусматривает дифференцированный подход к оценке с учетом стадии развития эмбрионов (морул и бластоцист) (табл. 12.2, 12.3).

Таблица 12.2

Шкала оценки морул (морула ранняя — МО 1, поздняя — МО 2)

Морфологическая

характеристика

Оценка

Баллов

Условное

обозна

чение

Округлая форма, прозрачная оболочка, перивителлиновое пространство прозрачное, бластомеры четкие, одинакового размера с наличием полигональной связи, зернистая цитоплазма равномерно заполняет оболочку

Отличные

5

+ +

Наличие в перивителлиновом пространстве гранул и включений, бластомеры неодинакового размера, расположены асимметрично, немного сжаты

Хорошие

4

+

Морфологическая

характеристика

Оценка

Баллов

Условное

обозна

чение

В перивителлиновом пространстве гранулы и включения, частичный зародыш, незначительное сжатие бластомеров, единичные разрушения клеток

Удовлет

вори

тельные

3

+ -

Деформация прозрачной оболочки, частичные разрушения бластомеров, нарушение связи между ними, фрагментация цитоплазмы

Условно

годные

2

+--

Несоответствие стадии развития возрасту эмбрионов, дефекты прозрачной оболочки (трещины, сколы), распад бластомеров, их сильное сжатие

Непри

годные

1

Таблица 12.3

Шкала оценки бластоцист (бластоциста ранняя — БЛ 1, поздняя — БЛ 2)

Морфологическая

характеристика

Оценка

Баллов

Условные

обозна

чения

Округлая форма, прозрачная оболочка имеет одинаковую толщину на всем протяжении, перивителлиновое пространство узкое, прозрачное, четкая дифференция клеток трофобласта и эмбриобласта, хорошо различима бластоцель

Отличные

5

+ +

Зона пелюпида утончена, полость бластоцисты большая, занимает все перивителлиновое пространство, имеет гладкую поверхность, четкую дифференциацию клеток, бластоцель не выражена, в перивителлиновом пространстве гранулы, включения, клетки трофобласта сжаты незначительно

Хорошие

4

+

Перивителлиновое пространство увеличено, имеет включения, гранулы, бластополость не выражена, нет дифференциации между клетками трофобласта и эмбриобласта

Удовлет

вори

тельные

3

+ -

Морфологическая

характеристика

Оценка

Баллов

Условные

обозна

чения

Дефект прозрачной оболочки (трещины, сколы), наличие гранул, клеточных фрагментов в перивителлиновом пространстве, частичное разрушение клеток, сжатие бластополости

Условно

годные

2

+--

Значительный дефект прозрачной оболочки, распад бластомеров, их рыхлое соединение

Непри

годные

I

- - -

Иногда неопытные специалисты могут перепутать компактную морулу (6—7-е сут развития) с неоплодотворенной яйцеклеткой.

Главным отличием эмбриона от яйцеклетки является наличие бластомеров, истончение прозрачной оболочки до 25 мк и несколько увеличенный диаметр морулы.

Использование эмбрионов отличного и хорошего качества дает двукратное увеличение их приживления. В сомнительных случаях можно поставить вымытые клетки в небольшом количестве питательной среды на 30—40 мин (или 12—24 ч) в термостат на диагностическое культивирование при температуре 37°С. Эмбрионы неудовлетворительного качества бракуют.

Предложены и другие методы оценки жизнеспособности эмбрионов — с использованием функциональных проб, специальных красителей, культивирования in vitro и in vivo (в яйцепроводах крольчихи), микрометрии, электронной микроскопии и др.

Хранение эмбрионов. От извлечения эмбрионов до пересадки их реципиентам проходит 2—3 ч; в течение этого времени после оценки необходимо сохранять жизнеспособность эмбрионов. Для этого их промывают в фосфатном буфере Дюльбекко с добавлением антибиотиков, засасывают в микропайеты вместе с небольшим количеством среды и хранят при комнатной температуре или поместив в 0,5 мл среды на часовое стекло. Биологически полноценные эмбрионы переносят в стерильную чашку Петри, дно которой покрыто влажной фильтровальной бумагой, и ставят в термостат (температура 37°С).

Необходимость сохранения жизнеспособности эмбрионов в течение более продолжительного времени возникает при отсутствии достаточного количества подходящих реципиентов, сомнительном качестве вымытых эмбрионов, небходимости создания банка эмбри-

онов с целью осуществления долгосрочных программ, для обмена генофондом между странами и континентами на коммерческой основе.

Предложено несколько способов хранения эмбрионов:

  • 1) кратковременное вне организма;
  • 2) кратковременное в организме;
  • 3) долговременное в сжиженых газах (криоконсервация).

Кратковременное хранение и культивирование эмбрионов. При разработке способа кратковременного хранения эмбрионов учитывали опыт культивирования клеток и тканей.

Кратковременное хранение эмбрионов вне организма осуществляют так. Их помещают в ампулы или полихлорвиниловые пайеты для осеменения в среде Дюльбекко, Хэма-10, В2-Менезо, модифицированном растворе Тироде или Кребс-Рингера. Наиболее подходящей средой оказалась среда ТСМ-199 с добавлением 20% эмбриональной сыворотки или сыворотки крови оленя. Среда должна быть обогащена углекислым газом. Засасывают эмбрионы со средой в пайеты таким образом, чтобы по краям образовались воздушные пространства длиной 1 — 1,5 см. Концы пайеты закрывают стальными шариками или полиэтиленовыми трубками и инкубируют при 37°С в термостате. Биологически полноценные эмбрионы можно культивировать при 37°С под слоем вазелинового масла: пастеровской пипеткой эмбрионы переносят в стерильную пробирку, содержащую 0,5—1 мл среды, наслаивают стерильное вазелиновое масло, накрывают тонкой фольгой и ставят в термостат. Можно также перенести эмбрионы в 0,2 мл среды на часовое стеклышко, накрыть слоем (25 капель) вазелинового масла, поставить в чашку Петри, находящуюся на эксикаторе, через который пропускают влажную газовую смесь (90% азота, 5% кислорода и 5% углекислого газа).

Биологически полноценные эмбрионы в оптимальных условиях культивирования сохраняют жизнеспособность 24—48 ч. В конце культивирования эмбрионы оценивают под микроскопом, жизнеспособные используют для пересадки.

На ранних стадиях развития эмбрионы можно хранить при невысоких плюсовых температурах, вызывающих обратное торможение метаболических процессов. Имеются сообщения о том, что температура 10°С позволяет продлять жизнеспособность эмбрионов до 5—6 сут. Наиболее чувствительны к охлаждению эмбрионы свиней, жизнеспособность которых резко снижается при 10—15°С. Чувствительны к охлаждению и эмбрионы крупного рогатого скота, особенно на стадии 8—16 бластомеров, хотя на стадии морулы и бластоцисты они хорошо переносят охлаждение.

Кратковременное хранение и культивирование эмбрионов (3—5 сут) в организме (яйцепроводах крольчих) при температуре тела позволяет совершать их межконтинентальные перевозки с последующей ретрансплантацией. Установлено, что пересаженные хирургическим путем в яйцепроводы крольчих эмбрионы овцы развиваются нормально до вылупления из прозрачной оболочки или имплантации. Полагают, что эмбрионы крупного рогатого скота на стадии восьми бластомеров и морулы можно также культивировать до 72—96 ч in vitro, а затем до 7 сут в перевязанных яйцепроводах крольчихи. Недостатком метода является повышенный риск травмирования в связи с увеличением числа вымывания и пересадок.

Криоконсервация (замораживание) эмбрионов. В 1953 г. О. Смит впервые заморозил эмбрионы кролика. В 1971 — 1972 гг. за рубежом были начаты целенаправленные опыты по замораживанию эмбрионов животных и человека (Р. Виттингем, Д. Вильмут, Л.Е.А. Роусон, Виледсен и др.). В СССР криоконсервация эмбрионов впервые осуществлена в 1979 г.

У крупного рогатого скота для замораживания наиболее пригодны 7—8-суточные эмбрионы отличного и хорошего качества, т.е. находящиеся на стадии бластоцисты (60—150 бластомеров, дифференцированных на эмбриобласт и трофобласт).Эмбрионы овец и коз замораживают на стадии морулы и бластоцисты на 5—8-е сут, эмбрионы свиней — на 4—5-е сут. Лучше переносят замораживание свежие эмбрионы.

Инструкцией по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота (1987) предусмотрено проведение замораживания при помощи отечественного автоматического программного устройства УОП-1, который состоит из электронного блока, камеры и емкости с жидким азотом.

Отобранные эмбрионы насыщают криопротектором — глицерином или диметилсульфоксидом (ДМСО). Криопротектор вводят в состав среды во избежание кристаллизации воды. Применяемые технологии замораживания предусматривают последовательное перемещение эмбрионов в растворы криопротектора возрастающих концентраций (глицерина — 0,25; 0,50; 0,75; 1,0 М; ДМСО — 0,35; 0,50; 1,0 и 1,5 М), приготовленные на фосфатном буфере Дюльбекко с добавлением 20% сыворотки крови и пенициллина. В каждом растворе эмбрионы выдерживают 5—10, а в последнем — 15—20 мин. Эмбрионы отличного качества можно сразу поместить на 30 мин в 1,0 м раствор глицерина или 1,5 М раствор ДМСО.

В.А. Яблонский (1988) указывает: если в качестве криопротектора используют глицерин, то вначале помещают эмбрионы на 10 мин в 3,3%-й раствор глицерина, затем на 14 мин — в 6,6%-й и на 30 мин — в 20%-й. В середине срока выдержки эмбрионы промывают в течение 5 мин путем ряда всасываний в пастеровскую пипетку и выпусканий. Указанные манипуляции с эмбрионами проводят на помещенных в чашки Петри часовых стеклах.

После насыщения среды с эмбрионами криопротектором ее переносят (по 1—4 эмбриона с 0,3—0,4 мл среды с криопротектором) в пробирки, ампулы или пайеты, их герметизируют (пробирки закрывают фольгой, ампулы запаивают, пайету закрывают с обоих концов пластиковыми пробками) и замораживают одно- или двухэтажным методом, медленно или быстро, поместив в программный замораживатель. В пайеты эмбрионы помещают в следующей последовательности: среда—воздух—среда и эмбрион—воздух—среда.

Медленное замораживание эмбрионов проводят так. Охлаждают эмбрионы с 20 до 6—7°С со скоростью ГС/мин. После достижения заданной температуры (за 4—5°С до начала льдообразования) для предотвращения осмотических изменений вызывают искусственную кристаллизацию среды. Это обеспечивается посредством введения в раствор зерен льда, кристаллина йодистого серебра или какого-либо переохлажденного предмета (например, охлажденным в жидком азоте пинцетом или пипеткой с намерзшей на конце каплей среды, проколов фольгу, быстро прикасаются к поверхности жидкости либо стенке пробирки или ампулы в зоне верхнего края столбика среды). Дальнейшее охлаждение ведут со скоростью 0,3°С/мин от -35 до -36°С, после чего быстро погружают в жидкий азот.

Медленно замороженные эмбрионы перед использованием подвергают оттаиванию на спиртовой бане — в стеклянной цилиндрической колбе температурой -50°С, в которую помещают пробирки или ампулы с эмбрионами. Оттаивание проводят при комнатной температуре со скоростью 4°С/мин до -10°С, после чего эмбрионы переносят на 5 мин на водяную баню температурой 20°С. Наконец эмбрионы переносят в среду, используемую для удаления криопротектора.

Технология быстрого замораживания эмбрионов, предложенная во Франции, основана на использовании среды (фосфатный буфер Дюльбекко + сыворотка крови), содержащей глицерин и сахарозу. Она заключается в следующем. В пайету последовательно засасывают 0,5 М раствора сахарозы, воздух, 1,0 М раствор глицерина с эмбрионом, воздух, 0,5 М раствора сахарозы. Охлаждают эмбрионы с 20°С до -7°С со скоростью ГС/мин, стимулируют искусственную кристаллизацию, после чего их охлаждают со скоростью 0,3°С/мин от -35 до -36°С, а затем со скоростью 0,1 °С/мин до -60°С и переносят в жидкий азот.

Оттаивают быстро замороженные эмбрионы (перед использованием) на водяной бане температурой 37°С в течение 30 с со скоростью 3°С/мин или в течение 10—12 с. Для этого пайету (пробирку, ампулу) быстро извлекают из канистры, погруженной в жидкий азот, и опускают в водяной термостат.

Оттаявшие эмбрионы вместе со средой переносят из пробирки или ампулы на часовое стекло для морфологической оценки. При нормальном качестве эмбрионов их отмывают от грицерина или ДМСО, последовательнно помещая в заранее приготовленные растворы криопротектора убывающей концентрации. На заключительном этапе их трижды промывают в среде без глицерина и выдерживают в ней 10—20 мин. По окончании промывания эмбрионы вновь оценивают на жизнеспособность, признанные годными заправляют в инструмент для пересадки.

Пайету после оттаивания 3—4 раза встряхивают для удаления пузырьков воздуха и смешивания ее содержимого, после чего оставляют на 15 мин в вертикальном положении. Подлупой сквозь стенку пайеты отыскивают эмбрион и оценивают его жизнеспособность.

В НИИ животноводства лесостепи и полесья УССР предложена следующая технология консервации: свежевымытые на стадии мо-рулы эмбрионы переносят на 10 мин в 0,5 М раствор ДМСО на среде ФБС, затем на 20 мин в такую же среду с 1,3 М ДМСО, после этого по 3—4 зародыша переносят в пробирку, содержащую 0,5 мл ФБС и 1 М ДМСО. Пробирку герметизируют и помещают в аппарат для охлаждения и замораживания. Для большего удобства эмбрионы можно помещать в специальные мини-пайеты, в которые сначала набирают '/4 объема среды с зародышем, затем пузырек воздуха и '/4 объема среды ФБС. После этого пайету герметизируют и переносят в аппарат для замораживания.

Замораживание проводят по следующей программе: с 22—25 до 6°С охлаждают со скоростью ГС/мин, искусственно возбуждают кристаллизацию среды, замораживают с -6 до -40°С со скоростью 0,3°С/мин, а с -40 до -60°С — со скоростью 0, ГС/мин, после чего переносят пробирки с охлажденными до -60°С эмбрионами в жидкий азот.

В ряде стран разработаны свои технологии замораживания и оттаивания эмбрионов — двухступенчатые, одноступенчатые, в соломинках, пайетах, содержащих одновременно две среды — для замораживания (жидкость Дюльбекко с 10%-м глицерином и находящимся в ней эмбрионом) и среды для оттаивания (жидкость Дюльбекко, содержащая 20% фетальной сыворотки или 4 г/л бычьего альбумина и 0,5 М раствор сахарозы). После оттаивания среды смешивают, выдерживают пайету 10—20 мин при комнатной температуре и пересаживают эмбрион рецепиенту.

Всю работу по приготовлению среды и замораживанию эмбрионов проводят с соблюдением требований асептики.

Замороженные эмбрионы хранят в заправленном жидким азотом сосуде Дьюара (например, марки «Харьков 34Б»), в котором их размещают в специальных канистрах.

После замораживания и оттаивания жизнеспособность сохраняет 44—63% эмбрионов.

Синхронизация стадии возбуждения полового цикла (охоты). Для

пересадки свежеполученных эмбрионов необходимо обеспечить проявление охоты у доноров и реципиентов. Сущность синхронизации сводится к применению отдельных приемов или гормональных средств для регулирования половой функции у реципиентов и доноров, чтобы вызвать у них одновременно стадию полового возбуждения в заранее намеченное время.

В больших стадах ежедневно бывает достаточное количество животных в состоянии охоты. Однако трудно предвидеть у скольких самок и когда она наступит. Поэтому в практических условиях чаще всего прибегают к искусственной стимуляции стадии возбуждения полового цикла и ее синхронизации у реципиентов. С этой целью чаще всего используют гормональные методы, в основе которых лежит стимулирование либо пролонгирование функции желтого тела или, наоборот, угнетение его функции.

В первом случае применяют инъекции прогестерона или различные методы введения его синтетических аналогов — прогеста-генов (хлормадинона ацетата, или КАП, медроксипрогестерона, или МПА, меленгестрол ацетата, или МГА, мегестрол ацетата, амола, диамола 1С1-79939, 1С1-80996 и др.), которые блокируют гонадотропную функцию гипофиза, не нарушая синтез ФСГ и Л Г, поддерживая существование желтого тела и высокий уровень прогестерона в крови. Фолликулы при этом созревают только до второй стадии, наступление же течки, охоты, общей реакции и овуляции тормозится. Прекращение введения животным прогестерона или проге-стагенов сопровождается интенсивным выделением гипофизарных гормонов и появлением у самок стадии возбуждения полового цикла.

Однако время наступления стадии возбуждения полового цикла у животных широко варьирует — от 2 до 6 сут, оплодотворяемость яйцеклеток снижается. Поэтому синхронизация половой функции указанным методом имеет ограниченное значение в технологии трансплантации эмбрионов. Ее вытеснила синхронизация половой цикличности с помощью простагландинов группы Ф2 и его синтетических аналогов — простина (США), клопростенола, эструмата (Великобритания), эстрофана (Чехословакия), энзапроста (Венгрия) и др., которые, обладая выраженным лютеолитическим и утерото-ническим действием, вызывают морфологическую и функциональную регрессию желтого тела и контролируют таким образом продолжительность полового цикла.

Разработано несколько схем синхронизации стадии возбуждения полового цикла (охоты) у коров (телок). Одна из них предусматривает две инъекции эстрофана с интервалом 11 сут. Повторно

эстрофан вводят на 2-е сут после инъекции донору ГСЖК или на 3-й сут после начала обработки ФСГ-П. При использовании любой из схем проводят витаминизацию реципиента: инъецируют внутримышечно тривитамин или тривит в дозе 15 мл на 1 -е, 10— 12-е и 21 — 23-е сут.

За животными-донорами ведут наблюдение для обнаружения признаков течки и полового возбужения, их три раза проверяют на наличие охоты. Реципиента закрепляют за донором в случае полного совпадения у них сроков начала охоты. В день пересадки эмбрионов ректальной пальпацией яичников доноров и реципиентов убеждаются в наличии функционально активного желтого тела.

Синхронизацию охоты у овец и коз в настоящее время проводят:

  • 1) с помощью прогестагенов в виде подкожных имплантантов или влагалищных лессариев (мелкопористых полиуретановых губок, пропитанных прогестагеном);
  • 2) посредством двукратной инъекции простагландинов группы Ф2 с 9—10-суточным интервалом;
  • 3) используя формирование групп реципиентов из числа овец, проявивших охоту в тот же день, что и доноры.

Синхронизацию охоты у свиноматок осуществяют путем аппликации прогестагенов после отъема поросят или введения гонадотропинов лактирующим маткам. При этом молодым свиноматкам вводят 900—1800 мг ГСЖК, а через 2 сут 500 ИЕ ХЧГ; циклирующим свиноматкам вводят гормональные препараты по одной из следующих схем:

  • • ГСЖК на 16-е сут и ХГЧ на 19-е сут цикла;
  • • металлибур на 20-е сут, ГСЖК на 21-е сут и ХГЧ на 23-е сут;
  • • прогестин тренболон с 19-х по 21-е сут, ГСЖК через 6 ч после

последней дачи прогестагена и через 78 ч — ХЧГ;

  • • с 14-х по 20-е сут оксольвен, через 24 ч сурфогон (400 МЕ ГСЖК,
  • 200 ИЕ ХГЧ) и через 70 ч после последнего введения гестагена —

ХГЧ.

Старым свиноматкам вводят ГСЖК в день отъема поросят или через 1 сут и через 2—3-є сут — ХГЧ. Можно начинать стимуляцию и на 18-е сут после отъема поросят.

Охоту у кобыл синхронизируют путем индивидуальной дачи с кормом прогестагена альтреногеста в дозе 0,044 мг/кг ж.м. в течение 15 сут или применения аналога простагландина флупростенола (эквимат) в дозе 25 М/кг с 14-суточным интервалом. Для стимуляции овуляции кобылам дополнительно вводят 2000—3000 ИЕ ХГЧ.

Пресадка (трансплантация) эмбрионов. До середины 1970-х гг. пересадку эмбрионов проводили в основном хирургическим методом, затем постелено стали переходить на нехирургический. Каждый из них имеет положительные и отрицательные стороны.

Трансплантация эмбрионов у крупного рогатого скота. Хирургический метод пересадки эмбрионов является полостной операцией, проводить которую следует в операционной, оборудованной универсальным фиксационным станком или операционным столом. Доступ к матке обеспечивается с помощью лапаротомии по белой линии живота под общим наркозом на лежащем в спинном положении животном или в области подвхдоха (голодной ямки) под местной анестезией. Подготовка животного к операции и операционный доступ к матке такие же, как при вымывании матки. Пересадка эмбрионов через разрез брюшной стенки в области правой или левой голодной ямки значительно проще и менее трудоемка.

В качестве инструмента для пересадки эмбрионов можно использовать модифицированную пастеровскую пипетку с воронкообразным расширением на конце капилляра и герметической резиновой насадкой на противоположном конце. В пипетку сначала набирают столбик среды Дюльбекко (1,5—2 см), затем такой же столбик воздуха, после чего засасывают эмбрион со средой и опять столбик воздуха и столбик среды. На пипетку надевают стерильный полиэтиленовый чехол или накрывают ее стерильной салфеткой и сохраняют в боксе в горизонтальном положении до пересадки.

Открыв доступ к внутренним органам, рог матки, прилегающий к яичнику с функционирующим желтым телом, подтягивают к разрезу, делают прокол стенки концом капиллярной трубки (или тупой иглой диаметром 1 — 1,5 см, или молочным катетером с последующим введением в отверстие капилляра пипетки) примерно в 5 см от маточно-трубочного соединения и выдавливают содержимое пипетки в просвет рога матки, на его слизистую оболочку. При этом нельзя касаться стенок матки; надо избегать повреждения сосудов и кровотечения.

При необходимости так же переносят второй эмбрион в другой рог матки. Закончив пересадку, проверяют, заняла ли матка исходное положение, и вводят в брюшную полость 250 мл физраствора с антибиотиками (до 500 тыс. ЕД пенициллина и стрептомицина в 50 мл раствора новокаина). Накладывают трехэтажный шов и клеевую повязку, оставляют реципиента под наблюдением в течение двух недель.

После хирургической трансплантации 52—90% (в среднем около 60%) коров становится стельными. Учитывая высокую эффективность хирургической пересадки эмбрионов, во многих центрах США, Канады, Австралии пользуются преимущественно этим методом. Следует, однако, иметь в виду, что нанесенные животному травмы вследствие резекции мыщц, невозможность многоразового использования животного, сложности самой операции сдерживают широкое распространение хирургического метода.

М.И. Прокофьев, В.Я. Ярных (1986) предложили способ и прибор для пересадки эмбрионов через прокол стенки таза на фоне низкой эпидуральной анестезии. Прокол рога и введение эмбриона контролируют рукой через прямую кишку.

Суги (1965) сконструировал инструмент, с помощью которого можно вводить эмбрионы в матку через отверстие в своде влагалища, минуя цервикальный канал.

Желание упростить технику пересадки эмбрионов привело к разработке нехирургического метода, предусматривающего перенос эмбриона в рог матки через цервикальный канад, т.е. по принципу искусственного осеменения. Первые опыты по нехирургической пересадке эмбрионов были проведены в начале 1960-х гг. Предложено несколько модификаций нехирургического метода пересадки эмбрионов. Трансплантацию эмбрионов реципиентам проводят на 7— 8-е сут после окончания охоты.

При разработке технологии нехирургической пересадки эмбрионов учитывали следующие особенности. Во-первых, ко времени пересадки цервикальный канал у реципиента плотно закрыт, чувствительность рецепторов повышена, в связи с этим в ответ на механическое раскрытие цервикального канала активизируется сократительная функция миометрия, что может привести к выбросу эмбриона. Во-вторых, в лютеиновую фазу полового цикла эндометрий отличается повышенной чувствительностью к микробному фактору. В-третьих, возможны повреждение кровеносных сосудов и попадание в полость рогов матки крови, которая обладает эмбриотокси-ческим действием.

Перед пересадкой эмбриона реципиента фиксируют в станке, хвост бинтуют и подвязывают к шее животного, область наружных половых органов и промежность моют теплой водой с мылом, дезинфицируют 2%-м раствором диоцида или 70%-м этиловым спиртом, делают низкую сакральную эпидуральную анестезию 2%-м раствором новокаина (5 мл), а сильновозбудимым животным также вводят миорелаксант комбелен (0,5 мл). Для блокирования рецепторов матки и предотвращения отторжения эмбриона предложено применять внутримышечно препарат ханегиф.

Применяемые в настоящее время инструменты состоят в основном из металлического катетера, длинной капиллярной трубки, в передней части которой имеется приставка для помещения эмбриона в минимальный объем среды. Вводят катетер в рог матки под постоянным контролем руки через прямую кишку (как при цервикальном осеменении с ректальной фиксацией шейки матки) и выдавливают зародыш из приставки на слизистую оболочку матки.

Нехирургическую пересадку эмбрионов можно проводить при помощи модифицированного металлического катетера Кассу (рис. 12.8), состоящего из трубки, толкателя и навинчивающегося наконечника. Прибор стерилизуют кипячением в течение 30 мин, дают ему высохнуть и до начала эмбриопересадки выдерживают в настольной бактерицидной камере с включенной лампой. Благодаря определенной гибкости инструмент позволяет вводить эмбрионы в среднюю часть рога матки. Рэсбек модифицировал инструмент, благодаря чему его можно вводить в любой участок рога матки.

Катетер Кассу

Рис. 12.8. Катетер Кассу

Эмбрион засасывают в стерильную пайету в такой последовательности: среда, пузырек воздуха, среда с эмбрионом, пузырек воздуха, среда, пластиковая пробка. Заправленную пайету помещают в наконечник катетера, последний навинчивают на трубку. Готовый к работе прибор передают технику по пересадке эмбрионов или кладут на непродолжительное время в термостат с постоянной температурой 37°С.

Подготовленный катетер Кассу с заправленной пайетой для пересадки эмбриона вводят во влагалище реципиента, затем под контролем руки, находящейся в прямой кишке, продвигают через церви-кальныи канал до середины рога матки на стороне яичника с желтым телом. Убедившись в правильности расположения прибора, медленно выталкивают содержимое пайеты в просвет рога матки. После этого осторожно вынимают катетер и передают его на обработку.

Предложенный для нехирургической пересадки эмбрионов прибор, разработанный ВИЖ, отличается следующей конструктивной особенностью: через металлическую трубку длиной 45 см и диаметром 4,5 мм с воронкообразным расширением на конце проходит катетер длиной 55 см, диаметром 3 мм, который с помощью переходника соединяется с микрошприцем. Концевую часть пластикового (уретрального) катетера заправляют эмбрионом в принятой последовательности (среда ФБС — воздух — среда с эмбрионом — воздух — среда ФБС). Непосредственно перед введением в половые пути прибор заключают в санитарный чехол из полиэтиленовой пленки. Стерилизуют инструмент как и в предыдущем случае, покрывают препаратом силикон. При необходимости сделать пересадку зародыша на другой ферме теплый (37°С) заряженный катетер тщательно укутывают, помещают в утепленный контейнер (или в заправленную водой искусственную вагину) и транспортируют в горизонтальном положении, избегая резких толчков и наклонов. В этом же контейнере при 37°С можно транспортировать запасные пайеты с эмбрионами.

Пересадку зародыша осуществляют так: металлическую трубку правой рукой вводят через половую щель по верхнему своду влагалища до шейки матки, вынимают защитный кожух; под контролем правой руки, введенной в прямую кишку, пластиковый катетер через канал шейки матки направляют к верхушке рога, со стороны которого в яичнике имеется желтое тело; плавным нажатием на поршень шприца выталкивают находящийся к концевой части катетера эмбрион вместе с питательной средой.

Аналогично можно ввести катетер в другой рог матки и провести так называемую билатеральную (двустороннюю) пересадку эмбрионов, хотя приживляемость их в контрлатеральном роге несколько ниже. Руку из прямой кишки надо вынимать только после завершения пересадки.

Если пересадку эмбрионов осуществляют с помощью двухканального прибора, разработанного ВИЖ, то после аппликации первого эмбриона из гениталий вынимают только пластиковый катетер, а оставшуюся в шейке матки металлическую трубку направляют в другой рог матки. Вставив в нее другой заправленный катетер, продвигают его близко к верхушке рога и проводят другую аппликацию эмбриона. Если пересадку эмбрионов осуществляют с помощью телескопического катетера французской фирмы ИМ В, то на его металлическое тело надевают пластиковый чехол, который закрепляют шайбой. Выдвигают вперед находящуюся внутри катетера скользящую металлическую трубку, подсоединяют к ней заполненный средой с эмбрионом зонд (аспибрион) и втягивают его внутрь катетера до стопора канюли. Надевают сверху санитарный чехол и вводят инструмент по верхнему своду влагалища до шейки матки. Направляют его под ректальным контролем в устье шейки матки, прорывают чехол и, легко массажируя шейку, вводят катетер через цервикальный канал в полость матки до изгиба ее ипсилатерального рога. Выдвигают с помощью металлической трубки аспибрион из катетера, подводят его в ближайшую точку к истмусу и с помощью металлического поршня выталкивают эмбрион в рог матки.

В значительной мере успех трансплантации эмбрионов определяется соблюдением правил асептики и антисептики, предупреждением травмирования гениталий, мастерством техника, здоровьем реципиента.

Животным-реципиентам после пересадки эмбрионов обеспечивают полноценное кормление, ежедневно предоставляют активный моцион. Не рекомендуется в течение 2 мес после пересадки вакцинировать, перегруппировывать, подвергать реципиентов другим стрессовым воздействиям.

Диагностику беременности осуществляют в три этапа. На первом этапе проводят рефлексологическое исследование (пробником) на 7—12-е сут после пересадки. На 14—18-е сут беременности диагностируют гормональным методом — по уровню прогестерона в крови или молоке (достоверность — около 85%). Через 2 мес после пересадки беременность подтверждают ректальным исследованием. Окончательно эффективность трансплантации оценивают по фактическим отелам.

При нехирургическом методе трансплантации приживляемость эмбрионов составляет 40—50% и более.

Трансплантация эмбрионов других животных. Пересадку эмбрионов у овец проводят только хирургическим способом под общим или местным наркозом путем лапаротомии по белой линии живота. В 1978 г. проведен первый международный обмен замороженными эмбрионами овец между Англией и Польшей. Летом 1979 г. проведен польско-болгарский эксперимент по трансплантации замороженных эмбрионов, хранившихся около года в жидком азоте и перевезенных самолетом из Кракова в Софию. Наилучшие результаты получены при пересадке эмбрионов на стадии 8—16 бластомеров.

Пересадку эмбрионов у свиней производят хирургическим методом, хотя Ц. Полджу и Б. Бей (1969) добились беременности у одной из 32 свиноматок после нехирургической пересадки. Оптимальным считается перенос 12—16 эмбрионов одному реципиенту. Приживляемость эмбрионов до 5-х сут после охоты 60%, позже — резко снижается (Прокофьев М.И., 1983). Разработан метод трансплантации с помощью лапароскопии, при использовании которого силиконизированный катетер диаметром 1,22 мм вводят через яйце-провод в рог матки. Так как у свиней наблюдается внутренняя миграция эмбрионов, их можно пересаживать только в один рог матки. При пересадке меньше четырех эмбрионов беременность не сохраняется.

У кобыл хирургическую пересадку эмбрионов осуществляют путем лапаротомии по белой линии живота на 1—3-е сут после овуляции. С помощью пастеровской пипетки эмбрион вводят в небольшом количестве среды в яйцепровод. 4—6-суточные эмбрионы пересаживают в верхушку рога матки (эффективность 53—60%). Размеры и строение шейки матки у кобыл облегчают введение катетера для нехирургического получения и трансплантации эмбрионов. Пересадку эмбрионов у кобыл можно проводить с помощью 55-сантиметровой пипетки, используемой для искусственного осеменения. Приживляемость эмбрионов нарастает с увеличением срока от овуляции до трансплантации. Эмбрионы кобылы сохраняют жизнеспособность в яйцепроводах крольчих, в том числе и при их транспортировании.

Распространение метода в коневодстве ограничено в связи с тем, что, во-первых, у кобыл с помощью экзогенных гонадотропинов трудно вызвать суперовуляцию, поэтому увеличение количества приплода от ценных кобыл может быть достигнуто за счет многократного получения единичных эмбрионов нехирургическим путем и, во-вторых, ассоциация по регистрации чистопородных лошадей не признает потомства, полученного путем искуственного осеменения или трансплантации эмбрионов.

 
<<   СОДЕРЖАНИЕ   >>